高效液相色谱法测定银杏叶提取物中总黄酮醇苷含量*



高效液相色谱法测定银杏叶提取物中总黄酮醇苷含量*

宋唯唯刘芬芬刘彩红

(泰山医学院药学院，山东泰安271016)

摘要：目的建立银杏叶提取物中总黄酮醇苷的HPLC含量测定方法。方法采用Hypersil ODS2色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)，以甲醇- 0.4%磷酸溶液(55:45)为流动相，检测波长360 nm，流速1.0 ml/min，柱温35℃。结果槲皮素、山奈酚、异鼠李素进样量分别在10.0~60.0 μg/ml、10.0~60.0 μg/ml、1.0~30.0 μg/ml 范围内线性关系良好，平均回收率分别为99.42%、99.92%、98.11%。结论本方法简单、准确,可以用于银杏叶提取物中总黄酮醇苷的定量分析。

关键词：高效液相色谱法； 银杏叶提取物； 总黄酮醇苷

银杏叶提取物(GBE)是银杏科植物银杏Ginkgobiloba.L.的干燥叶经加工制成的提取物[1],具有扩张冠状动脉血管、改善脑循环及明显的抗血小板活化因子等独特的药理作用，主要活性成分为黄酮类和萜类内酯[2]，它们是制定银杏叶提取物和制剂质量标准的重要依据。国内外制药行业所用的GBE的含量标准为:银杏黄酮质量分数 24%、银杏萜内酯质量分数 6%。不论是为衡量提取工艺的优劣和控制GBE的质量,还是为后续药理药效的实验研究提供可靠的数据,建立一种能稳定、可靠的定量分析其主要药效物质黄酮类化合物的方法是十分必要的。

银杏叶提取物含有 20多种黄酮类化合物,通常都以糖苷的形式存在,测定每一种黄酮成分的含量十分复杂,这些成分的苷元部分为槲皮素、山萘酚、异鼠李素，通过测定样品酸水解后三种主要甙元含量，再乘以一定的因子换算成总黄酮的含量[3]，是国际上公认的衡量银杏叶提取物内在品质的依据。因此，本研究以槲皮素、山萘酚、异鼠李素为对照品，建立了 HPLC法测定银杏叶提取物中总黄酮醇苷含量的方法。

1实验材料与方法

1.1仪器和试剂大连依利特EC2006高效液相色谱仪，包括UV230II紫外-可见检测器，P230II高压恒流泵(A、B泵)。对照品槲皮素、山柰素和异鼠李素购自中国药品生物制品检定所；银杏叶提取物样品购自西安昌岳植物化工有限公司。甲醇为色谱纯、磷酸为分析纯、水为双蒸水。

1.2对照品溶液的制备分别精密称取槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品置于棕色容量瓶中，用甲醇配制成浓度为1.0 mg/ml，1.0 mg/ml，0.156 mg/ml的对照品溶液，4℃保存，备用。

1.3样品溶液的制备精密称取银杏叶提取物约15 mg，置于100 ml圆底烧瓶中，加甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液25 ml，超声15 min，置电热套上加热回流60 min，迅速冷却至室温，转移至50 ml的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，3000 r/min离心5 min，0.22 μm的微孔滤膜过滤，既得。

2方法和结果

2.1色谱条件采用Hypersil ODS2色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)，流动相甲醇- 0.4%磷酸溶液(55∶45)，检测波长360 nm，流速1.0 ml/min，柱温35℃。色谱图见图1。

图1　对照品(A)及样品(B)的HPLC图谱

2.2线性关系考察精密吸取“1.3”项下槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品贮备液,加甲醇配制成一系列浓度的混合溶液：对照品溶液 1(槲皮素10 μg/ml、山奈素10 μg/ml、异鼠李素1.0 μg/ml)，对照品溶液 2(槲皮素20 μg/ml、山奈素20 μg/ml、异鼠李素3 μg/ml)，对照品溶液 3(槲皮素30 μg/ml、山奈素30 μg/ml、异鼠李素5 μg/ml)，对照品溶液 4(槲皮素40 μg/ml、山奈素40 μg/ml、异鼠李素10 μg/ml)，对照品溶液 5(槲皮素60 μg/ml、山奈素60 μg/ml、异鼠李素25 μg/ml)。精密吸取上述对照品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，以各对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，做线性回归，得槲皮素、山奈素、异鼠李素的回归方程，结果见表 1。

表1　槲皮素、山奈素、异鼠李素的回归方程、线性范围及相关系数

2.3精密度试验精密吸取混合对照品溶液 20 μl，连续进样6次，结果槲皮素、山奈素、异鼠李素峰面积的RSD分别为1.71%、1.89%、0.98%，均小于2.0%，表明该方法精密度良好。

2.4稳定性试验精密吸取供试品溶液 20μl，分别于配制后 0、 2、4、 8、 16、 24 h进样测定，结果槲皮素、山奈素、异鼠李素的RSD分别为0.89%、0.53%、0.75%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5重复性试验取同一样品6份，按照“1.4”项下方法制备供试品溶液，测定槲皮素、山奈素、异鼠李素的平均含量，再按总黄酮醇苷含量 = (槲皮素含量 +山奈素含量 +异鼠李素含量)×2.51计算，总黄酮醇苷平均含量为24.76%，RSD为0.89%。结果表明本法重复性良好。

2.6回收率试验取已知浓度的样品溶液(槲皮素6.0 μg/ml、山奈素4.8 μg/ml、异鼠李素4.0 μg/ml)，分别加入供试品含量80%、100%、120%的槲皮素，山奈素和异鼠李素对照品溶液，每种浓度各3份，进样20 μl，计算回收率，结果见表2。结果表明，该测定方法准确度较高,槲皮素、山奈素、异鼠李素的3个浓度下的平均回收率分别为 99.42%、99.92%、98.11%。

表2　回收率实验结果(n=9)

2.7样品含量测定精密称取银杏叶提取物0.0150 g，按照“1.4”项下方法制备供试品溶液，用外标法计算样品中槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量，分别为4 mg/g、3.2 mg/g、2.67 mg/g,按总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量×2.51计算，样品中总黄酮醇苷的含量为24.76%。

3讨论

为了使所检测的色谱峰分离度好，出峰时间合理，笔者在初实验过程中,分别比较了以下不同的流动相对测定结果的影响：甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)、甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)及甲醇-水(50∶50)(用磷酸调 pH=2.5)，结果选用甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶ 45)作为流动相时各个色谱峰的分离效果好。从以上方法学考察及试验结果可见，本测定方法准确，重复性好,稳定性较好，结果可靠，能够准确测定样品中总黄酮醇苷的含量。

参考文献：

[1]ChP(中国药典).2010.VolⅠ(一部):392-393.

[2]Teris A B，Paola M. Chemical analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves，extracts，and phytopharmaceuticals [J]. Chromatogr A, 2009, 1216(11): 2002-2032.

[3]赵一懿,郭洪祝,王京辉,等. 超高效液相色谱法同时测定银杏叶提取物中 11种黄酮苷类成分的含量[J]. 中国药学杂志, 2012, 47(24): 2032-2037.

关于学报论文中的量和单位

1)应严格执行GB 3100～3102有关量和单位的规定。

2)量的符号一般为单个拉丁字母或希腊字母，并一律采用斜体(pH例外)。为区别不同情况，可在量符号的右侧上、下方用上、下标标识。其中以量符号和代表变动性数字的字母作角标时用斜体，其他角标(包括数字)用正体。

3)在表达量值时，在公式、图、表和文字叙述中，一律使用单位的国际符号，且无例外地用正体。单位符号与数值间要空出1/4个字长。

4)不许对单位符号进行修饰，如加缩写点、下标、复数形式，或在组合单位符号中插入化学元素符号等说明性记号，等等。

5)图、表中用符号表示数值的量和单位时，应采用量与单位相比的形式，如m/kg，cB /mol·L-1。

6)指数、对数和三角函数中的变量等，都是数、数值或量的无量纲组合，如 exp( W/kT)，Ig(p /kPa)，sin(wt)。

7)统一用L(升)作为表示物质浓度的基准单位，而不使用μL，mL，dL以及mm3等作浓度单位的分母。

8)不能把ppm，pphm，ppb等缩写字作单位使用。

9)词头不得单独或重叠使用。如urn，不用u；mF，不用uuF。

10)组合单位的分母中一般不用词头。如kJ/mol不能写成J/mmol。

HPLC determination of total flavone glycosides in Ginkgo biloba extract

SONGWei-weiLIUFen-fenLIUCai-hong

(College of Pharmacy, Taishan Medical University, Taian 271016,China)

Abstract:Objective: To establish an HPLC method for the determination of the contents of total flavone glycosides in Ginkgo biloba extract. Methods: The analyses were performed on a Hypersil ODS2 column (4.6×250mm,5 μm), and the mobile phase was methanol-water containing 0. 4% phosphoric acid (55:45) at the flow rate of 1 ml/min. The detection was carried out at 360 nm, and the column temperature was 35℃．Results: The calibration curves of quercetin, kaempferide and isorhamnetin had good linearinities with good recoveries in the ranges of 10.0~60.0μg/ml,10.0~60.0μg/ml and 1.0~30.0μg/ml, respectively. The average recoveries of the method were 99.42%, 99.92% and 98.11% respectively. Conclusion: The HPLC method is simple, accurate, which can be used for the determination of the contents of total flavone glycosides in Ginkgo biloba extract.

Key words:HPLC method； Ginkgo biloba extract； total flavone glycosides

收稿日期(2015-09-23)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.01.011

中图分类号：R917

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2016)01-0033-03

通讯作者：刘彩红，女，主要从事中药活性成分的研究，E-mail: chliu@tsmc.edu.cn。

作者简介：*宋唯唯(1993—)，女，2012级制药工程本科一班。

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目(201410439028)。