低频强声对巴马香猪听功能及耳蜗毛细胞表面结构的影响

徐海艳　吴玮,　王刚　韩浩伦　李保卫　王鸿南　刘旭



低频强声对巴马香猪听功能及耳蜗毛细胞表面结构的影响

徐海艳1吴玮1,2王刚2韩浩伦2李保卫2王鸿南2刘旭2

【摘要】目的了解高强度低频率噪声(低频强声)对巴马香猪听功能及耳蜗毛细胞表面结构的影响。方法将8只巴马香猪随机分为对照组(2只)及实验组(6只)，均于实验前行听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)检测后，将实验组再分为噪声暴露后即刻、36小时及84小时组，每组2只；实验各组动物暴露于50 Hz、142 dB SPL的低频噪声中5 min，再于暴露后即刻、36小时、84小时分别行ABR检测，然后分别在扫描电镜下观察各组动物耳蜗毛细胞表面结构的形态变化。对照组不给予噪声暴露，其他步骤同实验组。结果8只(16耳)巴马香猪低频强声暴露前ABR反应阈值为91.25±10.72 dB SPL；实验组低频强声暴露后即刻、36 h及84 h所有动物双耳ABR均未能引出。实验组噪声暴露后即刻扫描电镜下可见内外毛细胞气球样变，外毛细胞静纤毛融合及散在性缺失；噪声暴露后36 h可见内外毛细胞轻度气球样变、静纤毛散乱；噪声暴露后84 h可见耳蜗底回内外毛细胞缺失，中回及顶回内外毛细胞静纤毛缺失，且以第三排外毛细胞静纤毛缺失最重；噪声暴露后听毛细胞表面结构损伤以基底回和中回为主，顶回损伤较轻。结论50 Hz、142 dB SPL噪声暴露后巴马香猪双耳ABR反应阈值较暴露前明显升高；扫描电镜下可见内、外毛细胞静纤毛融合、散乱及缺失等改变。

【关键词】低频强声；巴马香猪；听性脑干反应；毛细胞

网络出版时间：2015-12-2815：13

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20151228.1513.024.html

噪声是一种普遍存在于生活、职业环境中的有害因素，可导致人体心血管系统、消化系统、内分泌系统等多方面的损害，对听觉系统的危害是最显著及最特异的[1，2]。由于模拟低频率高声压级噪声发生装备受限，目前大多研究主要关注高频噪声对啮齿类动物听功能的影响及其噪声损伤的发生机制。而人类的生活环境中普遍存在低频噪声，且低频噪声具有衰减慢、声波长及较易穿越障碍物的特点，对人体的影响比高频噪声更长远[3]。因小型猪解剖结构与人类相似，目前已广泛应用于心血管系统、皮肤及糖尿病的研究，且近期研究发现小型猪作为哺乳动物出生时耳蜗已发育成熟，其中耳及内耳解剖及发育特点与人类极其相近[4]，因此，本研究拟探讨低频强噪声暴露对巴马香猪耳蜗毛细胞表面结构及听功能的影响。

1材料与方法

1.1实验动物及分组取外耳道洁净的健康巴马香猪(第三军医大学实验动物中心提供)8只，6月龄，体重10~20 kg，雌雄各半，分为对照组2只， 实验组6只，实验组再分为噪声暴露后即刻、36 h、84 h组，每组各2只。

1.2低频强噪声暴露方法由动力源、低频信号发射器、功率放大器和声源发生器组成(第三军医大学实验动物中心提供)发声设备，在声场内发出50 Hz、142 dB SPL低频强声(窄带噪声)，将实验各组巴马香猪置于该低频强声声场(各处声压级相同)内，持续暴露5 min。对照组不给予噪声暴露，其他饲养条件与实验组相同。

1.3听性脑干反应(ABR)测试于实验前各组动物在隔声静电屏蔽室内进行双耳ABR检测，实验各组分别于噪声暴露后即刻、36 h、84 h行双耳ABR检测。测试方法：3%戊巴比妥(1 mg/kg)耳缘静脉麻醉后颅顶正中接记录电极，测试耳参考电极，鼻尖处接地极，单耳闭合声场给声；刺激声为短音，带通滤波为100～3 000 Hz，信号放大100 000倍，刺激重复率21.1次/秒，声刺激持续时间100 μs，间歇期10 ms，叠加1 024次；刺激声强度从125 dB SPL开始，先以10 dB递减，接近反应阈时以5 dB递减，至刚好出现波形，再重复一次，以能重复出现稳定的波V判断为ABR反应阈值；如果125 dB SPL不能引出反应阈则默认其阈值为130 dB SPL。测试时注意动物保温。

1.4耳蜗毛细胞扫描电镜观察实验各组完成听性脑干反应检测后，迅速断头，用颅骨钻于颅顶打孔，咬骨钳将顶骨去除，完整剥离脑组织后，自颅底取出听泡，挑出镫骨后，暴露卵圆窗，用2.5%戊二醛溶液耳蜗内灌流固定,然后用灌注磷酸缓冲液(pH=7.4)冲洗，一侧耳蜗置于2.5%戊二醛固定液中4 ℃保存，用双氧水冲洗，再经1%四氧化锇后固定，双氧水冲洗，梯度酒精脱水，临界点干燥，离子溅射真空镀膜，Hitachi S4800扫描电镜(北京理化分析测试中心提供)下观察基底膜内外毛细胞结构的变化。对照组完成ABR测试后同法取耳蜗扫描电镜观察。

2结果

2.1各组巴马香猪噪声暴露前后ABR反应阈比较实验前8只巴马香猪(16耳)ABR反应阈为80~110 dB SPL，其中，左耳分别为90、105、80、105、80、80、90、110 dB SPL，右耳分别为80、105、95、85、80、90、85、100 dB SPL，16耳平均值为91.25±10.72 dB SPL；噪声暴露后实验组6只(12耳)动物ABR反应阈均未引出。

实验各组巴马香猪经低频强声暴露后耳蜗毛细胞表面结构产生改变，如毛细胞气球样变、静纤毛倒伏融合、基底板破裂等。噪声暴露即刻组基底回(图1b)内毛细胞气球样变，外毛细胞静纤毛散乱及散在性缺失；中回(图2b)内毛细胞气球样变，外毛细胞静纤毛散乱融合，指突、柱细胞头突起；顶回(图3b)内毛细胞静纤毛广泛性散乱、倒伏、融合。噪声暴露36 h组基底回(图1c)内外毛细胞气球样变，中回(图2c)内外毛细胞静纤毛散乱，顶回(图3c)内、外毛细胞轻度气球样变性。噪声暴露84 h组基底回(图1d)内外毛细胞广泛性缺失；中回(图2d)内毛细胞静纤毛广泛性缺失，外毛细胞气球样变及静纤毛散乱、倒伏；顶回(图3d)内外毛细胞气球样变。可见实验各组内、外毛细胞及其静纤毛以基底回和中回损伤(特别是基底回)为主，轻者以内、外毛细胞气球样变及其静纤毛散乱、倒伏为主，重者则出现严重的机械性损伤，如：内、外毛细胞静纤毛广泛性缺失甚至外毛细胞区表皮板破裂。

图1　各组动物耳蜗基底回扫描电镜观察

a.对照组，内外毛细胞正常；b. 噪声暴露后即刻组基底回：→内外毛细胞气球样变，↑外毛细胞散在缺失，第三层外毛细胞缺失较多，↓外毛细胞静纤毛融合；c.噪声暴露后36 h组基低回：↑内、外毛细胞气球样变为主；d.噪声暴露后84 h组低基底回：内、外毛细胞缺失

图2　各组动物耳蜗中回扫描电镜观察

a.对照组中回：内外毛细胞局限性轻度气球样变；b.噪声暴露后即刻组中回：↑内外毛细胞静纤毛散乱,轻度气球样变，→指突、柱细胞头突起；c.噪声暴露后36 h组中回：↑内、外毛细胞静纤毛散乱为主；d.噪声暴露后84 h组中回：↑外毛细胞静纤毛缺失

图3　各组动物耳蜗顶回扫描电镜观察

a.对照组顶回：→外毛细胞气球样变,以第三层外毛细胞为主；c.噪声暴露后即刻组顶回：内毛细胞正常,↑外毛细胞静纤毛融合；c.噪声暴露后36 h组顶回↑内、外毛细胞轻度气球样变；d.噪声暴露后84 h组顶回：↑内、外毛细胞气球样变，以外毛细胞为主；↓内毛细胞静纤毛局限性缺失

3讨论

目前在噪声对听功能影响的研究方面普遍选用豚鼠或小鼠制备动物模型，但啮齿类动物的听觉系统是出生后发育成熟的，且与人存在明显的种属差异；而小型猪作为哺乳动物与人类耳蜗在胚胎期的发育过程相似，出生时耳蜗已发育成熟，且小型猪的面神经的走形、鼓索神经分支的发出部位、三块听小骨的排列与人耳相似[4]；因此，小型猪也可作为中耳及内耳相关研究的良好动物模型。

动物的种属差异及月龄[5]大小可能会影响ABR反应阈，2月龄黑色贵州小型猪听性脑反应阈为25~35 dB[6]，1月龄荣昌猪及5~7周龄的越南小型猪ABR反应阈为40~50 dB SPL[5，7]；10~60日龄的巴马香猪ABR反应阈为25~30 dB SPL[8]。本研究选用的6月龄巴马香猪正处于青春期阶段[9]，噪声暴露前巴马香猪双耳平均ABR反应阈为91.25±10.72 dB SPL，ABR阈值较高可能与本实验选用的小型猪为6月龄较其他实验者所用动物月龄大有关。

王建军等[10]认为100 Hz、130 dB SPL的低频强声持续暴露4 h对豚鼠耳蜗毛细胞无明确的损伤，但开启了凋亡的程序。从本研究结果看，对照组内、外毛细胞静纤毛和豚鼠毛细胞静纤毛相比长短不齐，顶端毛细胞静纤毛比基底回的静纤毛长，和人耳蜗超微结构相类似[11]；实验各组耳蜗内、外毛细胞及其静纤毛的病理改变在耳蜗基底回、中回、顶回依次减轻，且以第三排外毛细胞及静纤毛损伤最重；该表现和既往关于高强度低频稳态噪声对大鼠耳蜗损伤的规律相似[12]。本实验观察到了低频强声对巴马香猪耳蜗产生了明显不可逆性的机械性损伤，与王建军等[10]实验结果有所不同，可能与该实验所用130 dB SPL的噪声[10]低于本实验所选用的142 dB SPL噪声声强有关。

Chen等[13]将大鼠置于115 dB、中心频率13.6 kHz噪声环境持续暴露4 h发现动物噪声性听力损伤程度和基底膜内、外毛细胞的缺失密切相关，噪声暴露后存活的毛细胞功能基本正常，而受损伤甚至缺失的毛细胞几乎死亡；一定数量的有功能的毛细胞是听觉敏感性的前提条件。豚鼠经166 dB的连续脉冲噪声暴露后出现耳蜗毛细胞静纤毛的折断、倒伏及表皮板的穿孔，以上结构的改变是形成永久性阈移的原因之一[14]。从本研究结果看，噪声暴露后84 h动物的基底回内、外毛细胞出现广泛性缺失；噪声暴露后不同时间各组耳蜗损伤轻者以内、外毛细胞气球样变及其静纤毛散乱、倒伏为主，重者则出现内外毛细胞广泛性缺失甚至外毛细胞区表皮板破裂等严重的机械性损伤；噪声暴露后实验各组动物ABR反应阈均未引出，因此推测低频强声暴露后巴马香猪双耳听性脑干反应阈上移与其内耳结构的不可逆性机械性损伤相关。

综上所述，6月龄正常巴马香猪ABR反应阈平均为91.25±10.72 dB SPL，经低频强噪声暴露后双耳听性脑干反应阈值明显上移，扫描电镜下可见耳蜗听毛细胞静纤毛融合、散乱及缺失等改变，且以基底回及中回损伤为主。今后拟增加样本量进一步探讨低频强声对耳蜗的损伤机制。

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(2015-03-25收稿)

(本文编辑周涛)

·实验研究·

The Effects of Intense Low Frequency Noise on Hearing Functions and

Hair Cell Surface Structures in Bama Pigs

Xu Haiyan*, Wu Wei, Wang Gang, Han Haolun, Li Bao wei, Wang Hongnan, Liu Xu

(*Chinese PLA Medical School, Beijing,100853,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of intense low frequency noise on hearing functions and hair cell surface structures in bama pigs.MethodsEight bama pigs were randomly divided into a normal control group(2 pigs) and experimental groups(6 pigs). Auditory brainstem response(ABR) was performed before and after noise exposure. The control group was not exposed to the noise but other conditions were the same as the experimental groups. The experimental groups(6 pigs) were randomly divided into immediate group,36 h group, and 84 h group(2 pigs per group),and then were exposed to intense low frequency noise at 142 dB,50 Hz for 5 min according to the three time points. ABR was tested again before the cochleas were collected at the different. The hair cell surface structures were examined with scanning electron microscope(SEM).ResultsFor 8 bama pigs(16 ears), the average ABR threshold before the noise exposure was 91.25±10.72 dB SPL, but they were not elicited after the exposure to the noise at the level of 142 dB,50 Hz for 5 min. The scanning electron microscopy showed inner/outer hair cells ballooning ,outer hair cell stereocillia fusion and sporadic deletion in the immediate group; 36 h group showed inner/outer hair cells ballooning , the outer hair cell scattered stereocillia;84 h group showed missing inner/outer hair cell in the basal turn, the middle and apical turns showed inner/outer hair cell missing stereocillia and greater damage in the third row .The hair cell surface structures showed greater damage in the basal and middle turn than apical turn.

1解放军医学院(北京100853)；2解放军第306医院耳鼻咽喉头颈外科

ConclusionABR thresholds were elevated after noise exposure. SEM showed inner/outer hair cell stereocillia fusion/scattered and deletion etc.

【Key words】Low frequency noise;Bama pig;Auditory brainstem response;Hair cell

通讯作者：吴玮(Email:entwuwei@126.com)

作者简介：徐海艳，女，河南人，硕士研究生，主要研究方向为噪声性聋。

【中图分类号】R764.43+3

【文献标识码】A

【文章编号】1006-7299(2016)01-0045-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.01.011