间充质干细胞促进外伤性脊髓损伤修复的相关机制

邹礼梁，王奎，陈健尔

间充质干细胞促进外伤性脊髓损伤修复的相关机制

邹礼梁，王奎，陈健尔

据统计，全球每年有25～50万人发生脊髓损伤（SCI）事件，年龄多在16～30岁[1]。根据其发病机理，脊髓损伤可分为原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤，原发性脊髓损伤是不可逆的，继发性损伤可通过干预手段如手术治疗、药物干预及干细胞移植等手段进行调控促进损伤的修复。然而，手术治疗容易引起二次损伤，激素治疗作用相对局限且不良反应较大。近年来，干细胞成为SCI治疗的新选择，尤其是间充质干细胞(MSCs)，其来源广泛、取材便利、易于纯化、细胞自我更新能力强、可多向分化且可自体移植，克服了伦理和免疫排斥等问题。MSCs促进SCI修复的作用机制也逐渐得到阐明，其可能相关机制主要有干细胞的替代填充机制，抑制细胞凋亡、调节细胞自噬机制，调节炎症、改善局部微环境机制、促进血管新生机制以及促进轴突抽芽生长机制等方面。本研究拟阐述MSCs促进SCI修复的作用机制，报道如下。

1 细胞填充、替代作用促进SCI修复

MSCs在SCI部位具有填充脊髓空洞和替代受损组织作用。Boido等[2]通过形态测定分析显示MSCs移植组的脊髓坏死灶体积与对照组相比缩小了31.6%，并发现迁移至损伤区域的MSCs能穿透胶质囊性区，逐步填充脊髓空洞区域，替代受损组织，抑制损伤部位囊性空洞的继续形成。顾卫东等[3]报道SCI模型MSCs移植组相对PBS注射组，其脊髓空洞体积显著缩小，脊髓残存白质的面积明显偏大且受损脊髓的病理改变也得到明显改善。这可能与MSCs具有多向分化的潜能，能在脊髓微环境的作用下定向分化为神经元样细胞和星形胶质细胞等特定的神经组织有关[4]。因为这些定向分化为神经元样的细胞聚集和填充于脊髓囊性病变区后，可在一定程度上替代损伤或坏死的神经组织，抑制损伤区囊性空洞的继续形成，从而促进脊髓功能的恢复[2]。

2 抑制细胞凋亡和调节细胞自我吞噬

脊髓发生损伤后会引起受损部位细胞凋亡（Ⅰ型程序性死亡）和细胞自我吞噬死亡（Ⅱ型程序性死亡），这也阻碍神经的修复和脊髓功能的恢复。而Jun-Lin等[5]报道植入体内的MSCs可通过抑制细胞凋亡和调节细胞自我吞噬保存残留的神经组织，为脊髓的修复提供一定的物质基础。

2.1 抑制细胞凋亡MSCs能合成和分泌抑制细胞凋亡的蛋白质，比如B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、生存蛋白和蛋白激酶B（Akt）等[6]。其中Bcl-2是调控细胞凋亡的关键蛋白，它可抑制细胞凋亡蛋白酶活化剂的释放，从而减少细胞凋亡。MSCs除了能合成直接抑制细胞凋亡的蛋白质，还能分泌血管内皮生长因子（VEGF），介导局部黏着斑激酶（FAK）磷酸化参与抗细胞凋亡过程。

2.2 调节细胞自我吞噬细胞自我吞噬具有两方面的含义：（1）细胞自噬触发细胞死亡程序导致细胞死亡，即细胞自我吞噬死亡（Ⅱ型程序性细胞死亡），多是由伤害性因素引起，如细胞结构的破坏；（2）细胞通过自噬现象保持细胞的自我更新和分化能力，即细胞干性的保持（程序性细胞存活），主要由内源性因素引起，如细胞的衰老和组织的再生[7]。细胞自我吞噬可表达两个重要标志物：微管相关蛋白轻键3B和自噬基因Beclin-1[8]。轻键3B与Beclin-1均参与自噬体的形成，可用于检测细胞自噬行为[9]。Yin等[10]报道在脊髓缺血或缺血再灌注损伤大鼠的脊髓中轻键3B和Beclin-1出现高表达现象，而MSCs移植后轻链3B和Beclin-1的表达出现明显的减弱，可见脊髓损伤后自噬体形成增多，而MSCs移植后自噬体的形成减少，降低了细胞自我吞噬的发生，从而有利于保存损伤区域的神经组织，为脊髓修复提供物质基础。

3 调节炎症反应，改善局部微环境

SCI后血脊髓屏障被破坏，炎症细胞聚集，中性粒细胞和巨噬细胞随同常驻的小胶质细胞趋化浸润，从而产生质金属蛋白酶（MMPs）以及其他水解蛋白酶和氧化酶、前炎性细胞活素，局部微环境进一步被破坏[11]。

MSCs植入体内后自身可分泌多种神经营养和生长因子[脑源性神经营养因子（BDNF）、神经生长因子（NGF）及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等]，抵抗NO介导的谷氨酸神经细胞毒性，保护神经元免受细胞毒性侵害；调节自由基代谢，增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等在神经元内的含量，减少自由基积聚，保护神经元免受自由基的攻击[12]。BDNF还可协同NGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等生长因子，刺激MSCs分化为神经样细胞，更进一步促进BDNF等营养因子的分泌[13]，改善受损部位微环境，促进神经组织修复。

Urdzíková等[11]发现，大鼠经鞘内移植MSCs后肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素4（IL-4）、IL-1、IL-2、IL-6和IL-12的水平相对减少，而巨噬细胞炎症蛋白-1（M IP-1）和依赖激活正常T细胞表达分泌的调节蛋白（RANTES）的水平有所增加，有效地减少炎症反应，而且多次重复植入干细胞能维持干细胞在损伤处产生的抗炎症反应等积极作用。此外，Lynch等[14]报道，损伤部位的小胶质细胞活化后，其细胞形态常表现为突起回缩，胞体相对增大乃至呈巨噬细胞样能采用阿米巴样的运动形式移向损伤区域，充当吞噬细胞的作用，清除凋亡细胞碎片，减轻炎症反应，但其移行机制目前仍不清楚。

4 促进SCI区域血管新生和血管重建

血管生成在SCI修复作用机制中起着关键性作用[15]。SCI后神经纤维的再生，突触的重建，组织的修复和功能的恢复，都需要血液的供应和营养的支持[16]。MSCs主要是通过分泌VEGF、血管生成素-1（Ang-1）和bFGF等促进脊髓损伤处的血管新生，稳定血管网络[17]。

4.1 VEGF VEGF作为一种多功能细胞因子，能促使血管内皮细胞增殖、分化、迁移及存活，促进血管新生和血管重建[18]。Hyuk等[19]将VEGF和PBS分别注入两组大鼠体内，并通过测量血管假血友病因子（vWF）阳性血管密度来确定血管生成的程度，结果发现VEGF显著增加了SCI区域vWF阳性血管的密度，而且是PBS组的5倍多，这表明VEGF可明显促进SCI区域血管的生成。VEGF主要是与内皮细胞表面的VEGF受体-1（VEGFR-1）和VEGFR-2结合激活胞内酪氨酸激酶，并通过触发下游多种信号通路促进血管新生[20]；从而改善损伤区域微循环，促进神经功能恢复。

4.2 bFGF bFGF具有促进内皮细胞分裂、增殖和分化，促进血管新生等生物学作用。马秀现等[21]报道bFGF能促进成纤维细胞、血管内皮细胞和上皮细胞快速增殖和分化，促使微血管生长分化，增加局部毛细血管数量。Toshihiro等[22]报道，bFGF较VEGF更显著地促进了血管平滑肌细胞的生长，但相比而言也更容易引起血管炎症反应。

4.3 Ang-1 Ang-1是一种分泌性的蛋白分子，可促进胞浆素及基质金属蛋白酶2（MMP2）的分泌，激活丝氨酸苏氨酸蛋白酶AKT，稳定细胞活力，抑制内皮细胞凋亡，减少血管的萎缩和退化，稳定血管网络[23]。为组织提供血液和营养支持，改善损伤组织微环境从而促进SCI伤口恢复。Herrera等[24]报道SCI后（6 h内）Ang-1表达显著下降可能与脊髓损伤后大量Ang-1被用来代偿损伤部位低蛋白水平，修复和稳定损伤区域血管等密切相关。Herrera等[25]通过核磁共振成像(MRI)观察发现联合应用VEGF和Ang-1后，SCI病灶体积明显缩小，而且SCI区域血管网络的稳定得到维持。

此外，MSCs还自分泌或旁分泌神经营养因子-3（NT-3）、IL-6、转化生长因子-（TGF-)等细胞营养和生长因子，具有促进细胞增殖、分化及存活等生物学意义。

5 促进SCI区域神经轴突抽芽和生长

顾卫东等[3]通过脊髓埋管实验发现，种有MSCs的导管中可见有新生轴突长入，未种MSCs的导管中没有发现轴突生长。Yin等[10]通过免疫组织化学和免疫荧光检测方法发现，与未植入MSCs的大鼠相比，已植入MSCs的大鼠的轴突再生标志物、神经元标志物、生长相关蛋白-43（GAP-43）和微管相关蛋白2（MAP-2）表达都明显增高。这都说明了MSCs具有促进神经轴突抽芽生长的作用。Liu等[26]通过对MSCs进行bFGF基因转染后移植到急性脊髓损伤的大鼠中发现，经过bFGF基因转染后的MSCs可以大量分泌bFGF等生长因子，有效地促进脊髓损伤区域轴突的抽芽再生，有利于大鼠脊髓损伤后神经功能的恢复。此外，MSCs还能合成细胞外基质成分，如层黏连蛋白、纤维连接蛋白，为组织提供营养和结构支持，引导轴突的生长，支持轴突再生，修复脊髓损伤区域[27]。

此外，脊髓受到损伤后，脊髓组织中一些对生长锥起负效应的蛋白或因子的表达出现上调，不利于轴突的抽芽和生长[28]。而MSCs分泌的多种细胞因子可以在一定程度上拮抗神经生长抑制因子，逆转NO介导的谷氨酸细胞毒性，减少自由基积聚，保护神经组织免受细胞毒性和自由基的侵害。

6 展望

MSCs在促进外伤性SCI修复方面具有非常广阔的应用前景，但我们对其各种修复机制的研究与认识尚存在一些问题和不足：（1）MSCs自/旁分泌对脊髓损伤区域微环境改变的相关机制还没有统一的定论；（2）MSCs移植至体内后，机体内的相关因子或蛋白是如何对干细胞的存活、增殖和分化进行调控；（3）目前机制研究主要以单一疾病模型的动物为研究对象，而MSCs在人体内的相关机制将更为复杂，需要更进一步的临床评估与研究。此外，MSCs植入受损机体的最佳时间、最优植入途径，以及移植治疗的临床安全性仍有待在动物实验和临床实验中做进一步的研究。只有明确了MSCs在不同的时间点通过不同的移植途径植入机体后对机体微环境造成的影响，明确微环境出现各种变化的机制原理，才能确保临床应用的安全性和效用的最大化，进而科学地指导和推进MSCs的临床应用。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.10.076

R651.2

C

1671-0800(2016)10-1404-03

2015-06-17

（本文编辑：钟美春）

浙江省公益性技术应用研究计划项目（2012C33066）；浙江省中医药科技计划项目（2012ZA123）

310053杭州，浙江中医药大学

陈健尔，Email:cje28@foxmail.com