血管生成因子-2表达对NSCLC的诊断及其靶向治疗价值*

杨绪莉 综述，姚登福审校（南通大学附属医院临床医学研究中心，江苏南通226001）

血管生成因子-2表达对NSCLC的诊断及其靶向治疗价值*

杨绪莉 综述，姚登福△审校
（南通大学附属医院临床医学研究中心，江苏南通226001）

非小细胞肺癌/诊断；血管生成素2；靶向治疗；综述

起源于支气管黏膜或腺体的肺癌分为非小细胞性肺癌（NSCLC，约85%）和小细胞性肺癌（SCLC，约15%），为多病因、多中心连续发展的恶性肿瘤。NSCLC 5年生存率低，术后复发率高，预后差［1-2］。肺癌的生长伴随癌组织缺氧诱导因子（HIFs）活性增加［3-4］，激活下游靶基因转录并编码血管生成因子-2（Ang-2）等表达增加，促进血管重建，改变血管通透性［5］，与癌基因（如ras，c-myc）、抑癌基因（如VHL、p53、PTEN）、血管内皮生长因子（VEGF）及微小RNA（miRNA）改变等明显相关，不仅影响肺癌的放化疗，而且使癌细胞更具侵袭性，易转移，但其机制尚待阐明。本文就Ang-2表达对NSCLC的诊断和靶向治疗的新进展作一综述。

1　Ang-2　分子结构与生物学功能

血管生成素家族包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4，基因分别定位于8q22、8q23、20q13和20q13，肽链分别由498、496、523和503个氨基酸组成。Ang-2共含有9个外显子和8个内含子，基因核苷酸中开放阅读框架（ORF）为1 491 bp，肽链相对分子质量为75×103，N端信号肽由含20个疏水的氨基酸组成，其中约200个氨基酸卷曲成螺旋结构域，折叠弯曲形成四级结构，是由内皮细胞产生的一组结构相似的糖蛋白，并存储在威贝尔-帕拉德小体（Weibel-Palade bodies，WPB），在受到刺激后可以被迅速释放，主要受体是血管内皮细胞表面的受体酪氨酸激酶-2（Tie-2），通过与Tie受体结合，可调节内皮细胞Tie-2活性［6］，使内皮细胞激活，降低内皮细胞的稳定性，破坏血管稳定性，并刺激已存在的血管及淋巴管增殖，形成新的血管及淋巴管，促进肿瘤生长及转移［3］。

2　NSCLC组织Ang-2　的异常表达

与非肺癌患者相比，肺癌患者，尤其是NSCLC患者，Ang-2的表达呈进行性增加，肿瘤的形成、进展、恶性程度和转移与血清中Ang-2水平明显相关［6-7］。NSCLC有较高的Ang-2和VEGF血清水平，且血清Ang-2与VEGF水平相互关联，Ang-2在破坏血管稳定性的同时，使VEGF的促血管生成作用增强［8］。Ang-1和Ang-2的配体均是表达在内皮细胞上的Tie-2，二者在血管发生中起关键作用［6］。NSCLC中Ang-1减少、Ang-2的表达明显增加，Ang-2通过活化Tie-2受体，拮抗Ang-1的作用，抑制平滑肌细胞及管旁细胞对血管形成的限制，破坏血管稳定性，使血管渗透性增加［9］，并激活内皮细胞，诱发和促进血管新生，Ang-2的表达与微血管密度成正相关［10］。癌组织血管内皮细胞大量增殖，促进肿瘤生长［5］。因此，血清Ang-2是NSCLC的临床标志［7］。

3　Ang-2　表达异常的机制

Ang-2是Ang-1的天然拮抗剂，通过自分泌作用与血管内皮细胞和管周细胞细胞膜Tie-2受体结合，抑制Ang-1，激活Tie-2［6］。NSCLC组织中Ang-2及其受体的表达明显高于癌旁组织，显示Ang-2与肺癌的发生、发展密切相关［3，8］。癌周血管重建区在毛细血管尚未形成时即可见癌组织中Ang-2表达增加，Ang-2参与血管新生的起始及延续过程，利于NSCLC细胞的增殖和远处转移［11］。

3.1Ang-2破坏血管稳定性Ang-2通过激活β1整联蛋白破坏血管稳定性［12］。Ang-1与Tie-2结合，保持血管稳定性。Ang-2激活β1整联蛋白，破坏血管稳定性。自分泌Ang-2信号令Tie-2沉默，促进β1整联蛋白正向拉长基质粘连，调节含钙粘连蛋白（VE-cadherin）的内皮细胞间的细胞-细胞连接。VE-cadherin和β1整联蛋白使Tie-2沉默的血管内皮细胞和肺微血管内皮细胞间的连接降低。Tie-2沉默的单层细胞的完整性被β1整联蛋白、磷酸肌醇-3激酶或Rho激酶抑制，或通过重新表达膜结合的Tie-2胞外域所拯救。此外，Tie-2沉默增加，而Ang-2阻滞抑制体外经内皮的肿瘤细胞迁移，Ang-2介导的β1整合素激活是内皮细胞不稳定的催化剂，解释了Ang-1和Ang-2有争议的血管功能。Ang-2通过β1整联蛋白沉积，促进细胞骨架改变、Tie-2沉默［13］。Ang-2调节血管中含VE-cadherin的内皮细胞间的细胞-细胞连接，破坏血管稳定性［12］。NSCLC组织中Ang-2过表达时，VEGFA呈优势表达，促进内皮细胞增生［14］，Ang-2通过破坏原始肿瘤的内皮细胞-周细胞的相互作用，有利于促进血管新生和增强血管通透性。

Ang-2通过配体-受体相互作用，募集表达Tie-2的单核细胞（TEMS）至肿瘤，从而促进血管形成。肺部内皮细胞钙-活化T细胞核因子（NFAT）途径特异性激活，通过删除其内源抑制剂，DSCR-1上调钙神经素通路，NFAT过表达，Ang-2导致肺转移显著增加。特别在肺中VEGF水平的增加，可触发钙-NFAT信号，反式激活肺内皮细胞的Ang-2。此外，在小鼠模型中，DSCR-1或Ang-2的受体、可溶性Tie-2的过度表达，可防止激活肺血管内皮，抑制肺转移。这些研究发现了在预转移性龛中血管生成的机制，并为肺转移提供新的靶点［13］。

3.2Ang-2促进肿瘤转移血管周细胞在肿瘤进展中促进或限制转移。增强周细胞消耗，缺氧肿瘤的Ang-2信号，可促进血管缺陷和转移。利用小鼠模型显示，血管靶向疗法阻滞Ang-2的作用，抑制肺转移［8］。晚期肿瘤的淋病奈瑟菌（NG）阳性周细胞消耗也能降低肿瘤的生长，在NG2-TK小鼠中，晚期肿瘤的周细胞消耗可减少肿瘤体积60%［15］，PDGFRβ-TK小鼠减少了25%［8］，原发肿瘤微环境周细胞如同重要的警卫员，阻止肿瘤的进展和转移；周细胞减少造成缺氧相关的上皮间质转化和蛋氨酸信号通路介导的转移［15］。VEGF激活钙调神经磷酸NFAT通路，增加肺内皮细胞Ang-2的优先转录，促进肺肿瘤转移。表明肿瘤来源的VEGF和Ang-2诱导转移的机制有一定联系。在内皮细胞，VEGF的信号增加细胞内钙水平，从而激活NFAT介导的转录靶基因。VEGF结合血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）引起胞内钙离子增加，其激活了肺内皮细胞中NFAT介导的Ang-2的转录。尽管炎症细胞不表达Ang-2，激活的NFAT在转移相关炎症细胞中或许以一种与Ang-2无关的方式增强了其转移前功能［16］。VEGF、Ang-1及其他因子如成纤维细胞生长因子2等刺激淋巴管生成［17］，与新生血管可促进肿瘤的转移。此外，高剂量白介素-2（HDIL-2）治疗晚期恶性肿瘤时可刺激Ang-2的分泌，血清Ang-2浓度升高，增加内皮通透性，与肿瘤转移和肺功能障碍相关［18］。

3.3microRNAs（miRNAs）在NSCLC中表达异常miRNAs在NSCLC的发生、发展中起重要作用。miRNA是一类高度保守的非编码小RNA分子，约有18～25个核苷酸长度，在转录后水平调节基因的表达；在内皮细胞功能和血管生成中起重要作用，主要分为促进和抑制肿瘤生长、血管生成两类。其表达失调与NSCLC的恶性转化、血管生成和肿瘤转移相关［19］。NSCLC肿瘤体积增大，造成细胞缺氧，miRNA可通过缺氧诱导因子（HIF-1α）信号通路［20］或整联蛋白β受体［19］，直接或间接作用于Ang-2，破坏血管平滑肌功能［21］，调节内皮细胞，调控血管生成。核转录因子6（KLF6）调节VEGFA的表达和分泌，miRNA通过抑制KLF6并提高体内VEGFA水平，促进血管新生，增加微血管密度［22］，或直接靶向 VEGF而破坏肿瘤诱导的血管形成［23-25］。部分 miRNA与上皮间质转化（EMT）/间质上皮转化（MET）调节相关。EMT使细胞间的黏附减弱，细胞极性丧失，并使细胞获得迁移和侵袭特性，利于转移。MET允许癌细胞从原位癌转移至远处器官并克隆，如miRNA-200家族［26］。miRNA-200也可靶向肿瘤内皮细胞和肿瘤细胞分泌的IL-8和CXCL1，抑制EMT和血管新生。miRNA可通过上调p21和下调cyclinD1的表达或抑制Src蛋白及其引发的Src/Ras/ ERK通路，从而抑制肿瘤细胞增殖和生长及血管生成，抑制癌细胞的生长、黏附、迁移和侵袭能力［27-28］。在NSCLC中，部分miRNA表达上调，通常被认为是一种癌基因［29］。

4　Ang-2　表达对NSCLC的靶向治疗价值

NSCLC中Ang-2高表达可破坏血管稳定性，增强VEGF的促血管形成作用，联合应用Ang-2和VEGF抑制法，抑制NSCLC组织中Ang-2和VEGF［30］。或利用基因工程方法，抑制癌组织中Ang-2和VEGF的转录、翻译，将有利于抗血管治疗，也有助于了解NSCLC生长和转移的具体机制［3］。Ang-2的阻滞剂干扰Ang-2与Tie-2间的相互作用［6］，增强内皮细胞-细胞节点的完整性及Tie-2信号转导来提高内皮细胞间连接的完整性，阻断Ang-2，抑制NSCLC细胞穿过内皮细胞层，继而抑制肿瘤生长、肿瘤血管生成及淋巴结和肺转移［12-13，31-32］。虽然循环TEMs促血管生成，暴露于肿瘤衍生的Ang-2能刺激这些细胞表现出更广泛的、促进肿瘤生长的表型出现。这样，Ang-2-TEM轴可成为抗血管生成的癌症疗法的新靶点［33］。Ang-2募集TEMs至肿瘤部位，释放细胞因子表达促血管生成表型［34］。通过干扰TEM信号，抗体靶向Ang-2抑制肿瘤的生长和转移［35］。肿瘤中复杂的血管生长的调节参与提供自适应机制，这些机制包括遗传变异和微环境的相互作用，从而促进抗血管生成治疗应答中的耐药机制迅速出现［36-37］。

Ang-2也介导炎症过程。Ang-2在多发性炎症性疾病中表达上调，并涉及直接控制炎症相关的信号途径，因此，靶向治疗Ang-2应考虑此因子在调节血管生成和炎症反应中的双重作用。NSCLC中，Ang-2上调抵消了靶向VEGF的抗血管生成治疗，VEGF和Ang-2的双重抑制大大增强了抗血管治疗的疗效。Ang-2是联合抗癌治疗的一个有希望的候选疗法，因为靶向2个主要的促肿瘤生成的过程，血管生成和炎症［38］。靶向Ang-2的抗血管生成作用依赖药物浓度，药物的渗透能力取决于其理化性质，但其中的低传递的主要原因为肿瘤异常的血管，这是化疗药物均匀分布到肿瘤组织的关键障碍［39］。NSCLC血管异常也会导致肿瘤细胞对放疗和许多化疗药物的耐药性。血管壁结构的异常（如内皮细胞间存在较大的间隙），周细胞覆盖和功能缺失，不连续或基底膜缺失，以及促血管生成因子（如Ang-2和VEGF）的存在，有助于增加肿瘤血管的通透性。其直接后果是血流速度缓慢下降和血浆大分子的流出增加（如纤维蛋白原），导致间质高渗透压。在同种肿瘤和不同肿瘤的血管通透性的空间和时间性变化，使这种情况的复杂性增加［40］。

NSCLC的肿瘤治疗方法中，有一种被称为“血管促进疗法”的方法，通过增加肿瘤血管密度、血流量、渗漏和扩张，可以增加化疗药物传递和细胞内药物的吸收和减少缺氧，从而降低肿瘤的生长和转移。低剂量抗血管生成药物西仑吉肽能增强肿瘤血管新生，钙通道阻滞剂可增加血管扩张和血流，因此推测，联合使用以上2种药物将提高化疗药物吉西他滨的传递。化疗药物吉西他滨摄取到细胞内是由平衡核苷转运蛋白1（ENT1）和ENT2调节，以及由集中核苷转运蛋白3（CNT3）。这项研究提供了一个有趣的治疗癌症的方法，即通过促进血管形成，而非抑制来治疗。这些结果指向了治疗策略一个可能的根本性改变，通过血管的促进治疗，显著减少化疗药物的有效用量。通过提高肿瘤内传递和细胞间摄取细胞毒性药物，血管促进治疗可最大限度减少治疗的不良反应。这一策略可提供机会延长治疗，并不会降低生活质量［41］。VEGF抑制剂的血管正常化是一个增强抗肿瘤作用的策略化疗药物，但呈时间和剂量依赖，因此，难以实现临床。血管促进疗法和抗凝治疗目前正在成为新的机会，以提高抗癌疗法的疗效［42］。

miRNA通过抑制mRNA的稳定性或靶基因的翻译，在转录后水平调节基因的表达，其在NSCLC的Ang-2靶向治疗中发挥着重要作用。Ang-2在血管生成和肿瘤进展中起重要作用，而miRNA是新兴的血管生成重要调节剂。miRNA靶向作用Ang-2，通过破坏Ang-2的促血管生成活性抑制肿瘤进展。例如，miRNA-542-3p通过结合Ang-2mRNA的3′非转录区域（UTR），从而抑制Ang-2 mRNA的转录，减弱血管生成和肿瘤的生长和转移。此外，miRNA-542-3p水平与肿瘤进展呈负相关。这一现象揭示了一种新的调控通路，抗血管生成的miRNA-542-3p，通过该通路直接靶向促血管生成的关键蛋白Ang-2，提示miRNA-542-3p是抗血管生成治疗的希望靶点和监测疾病进展的潜在标志物［43］。miRNA在调节癌细胞的抗癌治疗敏感性中起重要作用。通过靶向VEGF-VEGFR2途径，调节癌细胞的敏感性［26］。靶向VEGF信号通路上的Ras基因抑制miRNA，可以减少NSCLC细胞的增殖、转移及浸润［44-45］。

5　Ang-2　表达对NSCLC的诊断及预后价值

5.1Ang-2表达对NSCLC的诊断价值肺癌组织的增长和癌细胞的转移均依赖于新生血管的生成。血管生成相关的Ang-2表达，和VEGF的表达一样，是缺氧引起的，是大部分癌症的一个标志性的特征［3，46］。肿瘤体积增大，缺氧增加，组织中缺氧诱导因子（HIF-1α）表达增加，诱导Ang-2及VEGF过表达［47］。随着NSCLC的阶段发展，血清Ang-2水平增加，有远处转移的患者比没有转移的患者水平高，因此，血清Ang-2是NSCLC的临床标志。无创性成像在癌症评估中起关键作用，新的功能和分子成像技术可以深入了解肿瘤的标志，包括血管生成［48］。预测早期NSCLC患者术后生存率和复发率的潜在标志。miRNA参与肺癌的发生及耐药，miRNA与克服耐药并使癌细胞对化疗、放疗及靶向治疗重新敏感相关。miRNA将来可以辅助肺癌的诊断和治疗［49］。

5.2Ang-2表达对NSCLC的预后价值随访NSCLC患者，Ang-2和VEGF低者总生存率高，生存时间较长，Ang-2、VEGF高者，无复发，生存率低，患者预后差［50］。Ang-2过表达与肿瘤的侵袭性密切相关。高密度淋巴管和高密度肿瘤内微血管被证明是NSCLC的独立预后指标［17］。体循环中的Ang-2 mRNA水平对预测靶向治疗相关的生存利益来说是一个有力的指标［51］。血Ang-2表达在早期NSCLC中常见［52］，是诊断NSCLC有用的标志［53］。miR-141和miR-200c高表达，通过间质上皮转化和血管生成，使NSCLC腺癌患者生存期缩短，是独立的预后因素［22］。miR-200通过抑制关键促血管生成因子（IL-8、CXCL1）调节血管生成，IL-8高表达与肺癌的不良预后相关［54］。NSCLC中miR-182高表达与肿瘤细胞迁移和转移、低生存率相关，是一个独立的阳性预后因子［55］。

6　展　望

NSCLC是最常见的恶性肿瘤，发病机制复杂，是连续、多病因及多中心的不断发展过程，其发生、发展及转移有赖于肺新血管形成，Ang-2在NSCLC发展过程中起重要作用。以肺癌中Ang-2靶向治疗可抑制肿瘤血管形成，从而阻断肺癌生长或转移的营养和氧气供给。针对Ang-2/Tie-2需更多临床试验研究其靶向作用。NSCLC的miRNA的靶向Ang-2治疗及抗血管生成药物的前景，需要临床验证预后和预测生物标记，以确定患者的最有效的治疗方法。

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A

1009-5519（2016）07-1014-05

国家国际科技合作专项（2013DFA32150）。

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（2015-12-10）