基于1H NMR 技术对COPD急性加重期血清特征性代谢物的研究

杨秀云 黄飞华 吴美倩 张永建 王晓平 杨中良⋆

基于1H NMR 技术对COPD急性加重期血清特征性代谢物的研究

杨秀云 黄飞华 吴美倩 张永建 王晓平 杨中良⋆

目的 采用1H 核磁共振（1H NMR）代谢组学技术研究慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期血清的特征性代谢物。方法 31例COPD急性加重期患者（急性加重组）入院后24h内及经过常规治疗进入稳定期（稳定组）后各采集空腹静脉血2 ml，离心取血清置-80℃冰箱保存，应用高分辨率1H NMR技术检测得到两组患者血清的一维氢谱图，采用SIMCA-P+软件对氢谱图进行分段积分后的积分值进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）以判别两组血清代谢物有无差异。采用正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）判断差异性代谢成分。结果 PCA和PLS-DA分析提示两组血清代谢物及其积分值存在部分交叉，但仍存在一定的差异，ROC分析提示模型较为可靠。OPLS-DA分析提示，与稳定组比较，急性加重组血清3-羟基丁酸、赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨和丙酮酸水平明显升高，而缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）水平明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。说明COPD急性加重期存在严重的能量、蛋白质及脂类代谢紊乱。结论 COPD急性加重与能量、蛋白质及脂类代谢紊乱有关。由于纳入研究的样本量有限，本研究结果尚需大样本研究证实。

慢性阻塞性肺疾病 急性加重 特征性代谢物1H 核磁共振 代谢组学

慢性阻塞性肺疾病（COPD）在我国患病率占＞40岁人群的8.2%，病死率高，已成为一个重要的公共卫生问题［1-2］。COPD是世界人口致残和死亡的主要原因之一［2-3］。COPD患者频繁的急性发作可导致肺功能下降［1］，最终引起生活质量的下降和生存寿命的缩短。急性加重最常见的原因为气管支气管树的感染和空气污染，但是约有1/3的严重急性加重期患者原因不明确［4］。本研究采用基于1H 核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）代谢组学技术，筛选COPD急性加重期患者血清的特征性代谢物，从代谢水平探索COPD急性加重的形成机制，为COPD急性加重的防治提供新思路和新策略。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2013年1月至2014年12月期间浙江省立同德医院呼吸内科住院患者31例，均符合COPD急性加重诊断标准［1］，属于肺功能Ⅲ级的患者。本研究未对运动和饮食情况进行评估，为减少饮食对研究的影响，所有受试者禁食后于次日清晨采集静脉血。纳入标准：COPD急性加重期病例，肺功能Ⅲ级，即第1秒用力呼气量（FEV1）占预计值百分比30%～49.9%，FEV1/FVC＜70%；年龄40～75岁；经检查血、尿常规、肝肾功能、血糖及血脂正常；心电图无明显异常，X线胸片示慢性支气管炎、肺气肿。排除标准：合并有结核、真菌感染、肿瘤及其他肺部原发性疾病者，合并心功能不全、肺性脑病等危重疾病者；合并心血管、泌尿、消化、造血、内分泌、代谢系统等严重疾病者；精神性疾病不配合者；妊娠或哺乳期妇女。本项目得到本院伦理委员会批准，并获患者知情同意书。

1.2 分组 急性加重组：即COPD急性加重期患者31例，其中男15例，女16例；年龄51～81岁，平均（70.1±10.5）岁。吸烟者15例；FEV1占预计值（39.5±12.3）%，FEV1/FVC为（55.2±19.7）%。其中合并高血压Ⅰ级3例，合并冠心病2例。根据病情给予化痰［沐舒坦，上海勃林格殷格翰药业有限公司，规格100ml（0.6g）］，口服，10ml/次，2次/d、解痉平喘（信必可都保吸入剂，SE-151 85 Sodertalje，Sweden，规格80μg，4.5μg/吸，1～2吸/次，2次/d）及控制性氧疗（2L/min鼻导管吸入，12～15h/d）等常规治疗。急性加重期患者并予相应的抗菌素、全身激素及局部雾化等治疗。稳定组：经上述治疗进入稳定期后，即为稳定组。

1.3 标本的采集和制备 急性加重组患者入院＜24h及稳定组患者分别于清晨空腹采集静脉血2ml，3000r/ min，离心10min，分离血清密封后置-80℃冰箱中保存备用。

1.4 代谢物的检测和分析 （1）检测仪器和样本的处理：核磁管，美国norell公司；重水（Deuterium oxide/ D2O），美国CIL公司。离心机（Centrifuge 5415D），德国Eppendorf公司；液体快速混合器（YKA），江西医疗器械厂；Agilent NMR System 600MHz DD2谱仪，美国Agilent公司；软件：SIMCA-11.0，瑞典Umetrics公司；MestReNova软件（V7.0），西班牙Mestrelab。样品的处理委托上海阿趣生物科技有限公司完成。充分混匀解冻的血清样品后，取200μl血清与重水配制的400μl磷酸盐缓冲液充分混匀。然后，4℃，12000 rpm离心10min，取上清液550 μl加入核磁样品管（Norell，ST500-7）。（2）核磁共振氢谱的测试：在高分辨核磁共振谱仪（Agilent 600 DD2，USA）上进行NMR检测，1H 频率为600.11MHz，配备三共振高分辨探头，采样温度为298K，采样次数为64次，谱宽20ppm。每个样品采样前控温≥5min，每个样品的90°脉冲宽度调整为10μs左右，等待时间（Recycle delay，RD）为2s（期间进行预饱和压水）。每个样品进行预饱和压水峰的CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）（RD -90°-（τ-180°-τ）n-ACQ）实验，总的自旋-自旋回波时间（2nτ）为200ms，在弛豫延迟期间进行预饱和压水。获得一维核磁共振氢谱图。（3）数据处理及分析：采用MestReNova软件（V7.0）对氢谱图进行傅里叶变换，手动相位调整、基线校正和谱峰对齐，血清氢谱图以乳酸在1.33ppm处的双峰定标，积分区间为9.5～0.7ppm，积分间距为0.002ppm，去掉6.0～5.5ppm处的尿素峰，5.214～4.450ppm包含残余的水峰及其影响的邻近的谱峰。采用SIMCA-P+（V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden）软件将归一化后的积分数据利用主成分分析法（PCA）进行分析，得到PCA得分图。使用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），发现NMR数据（X变量）和其它变量（Y变量，分组信息）之间的相关性。PLS-DA使用自适换算（unit variance scaling）的数据标度换算方式。PLS-DA对模型的质量用交叉验证法进行检验，并用交叉验证后得到的 R2X（模型累优化程度）、R2Y（反应变量Y的变异百分率）和 Q2（模型累积预测度）对模型有效性进行评判，采用受试者操作曲线（ROC）检验模型的可靠性。（4）特征性代谢物的发现和鉴定：对PLS-DA模型进行正交矫正处理（OPLS-DA），最大化凸显组间的差异。通过自由度和P=0.05水平时差异显著性确定代谢物相关系数│r│的界值，│r│值越大表示差异性越大，r为正值或负值的代谢物是在患者血清中降低或增加的代谢物。

图1 两组血清1H NMR氢谱图（a． 急性加重组 b． 稳定组）。注：1-MH：甲基组氨酸；3-HB：3-羟基丁酸；Ace：乙酸；Acet：丙酮；Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰氨；Cho：胆碱；Cit：柠檬酸；Cr：肌酐；DMG：二甲基甘氨酸；For：甲酸；G：丙三醇；Glc：葡萄糖；Gln：谷氨酰氨；Glu：谷氨酸；Gly：甘氨酸；GPC：甘油磷酸胆碱；HX：次黄嘌呤；Ile：异亮氨酸；L1：低密度脂蛋白（LDL），CH3-（CH2）n-；L2：极低密度脂蛋白（VLDL），CH3-（CH2）n-；L3：LDL，CH3-（CH2）n-；L4：VLDL，CH3-（CH2）n-；L5：VLDL，-CH2-CH2-C=O；L6：脂类6，-CH2-CH=CH-；L7：脂类7，-CH2-C=O；L8：脂类8，=CH-CH2-CH=；L9：脂类9，-CH=CH-；Lac：乳酸；Leu：亮氨酸；Lys：赖氨酸；NAG：N-乙酰糖蛋白信号；OAG：O-乙酰糖蛋白信号；PC：磷酸胆碱；Phe：苯丙氨酸；Pyr：丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Val：缬氨酸。

2 结果

2.1 COPD急性加重期与稳定期血清1H NMR氢谱图 COPD急性加重组与稳定组血清样本中具有代表性的代谢物1H NMR氢谱图、谱峰、化学位移及信号强度分析结果，见图1。其中化学位移δ5.4～9.0（虚线框内）区域比δ0.7～5.4区域放大16倍以清晰显示。

2.2 主成分（PCA）分析 急性加重组与稳定组主成分积分值集中分布于椭圆形散点图（95%置信区间）的2、3象限和1、3、4象限，虽存在部分交叉，但两组间仍存在一定的差异。见图2。

图2 两组血清1H NMR氢谱图数据的PCA得分图（a．急性加重组 b．稳定组）

2.3 PLS-DA分析及对模型的验证 PLS-DA对模型质量进行检验及对模型有效性进行评判，急性加重组与稳定组血清样本中具有代表性的代谢物虽有部分交叉，但差异有统计学意义（P＜0.05），模型ROC检验结果AUC=0.916，表示模型比较可靠。

2.4 OPLS-DA 急性加重期和稳定期血清代谢物虽存在部分交叉，但前者以第二、三象限为主，后者以第一、二象限为主，差异有统计学意义。

2.5 COPD急性加重相关特征性代谢物的筛选 与对照组比较，急性加重组血清3-羟基丁酸、赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨和丙酮酸水平等明显升高，而缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脂类VLDL、脂类LDL及脂类9水平明显下降（P＜0.05）。

3 讨论

代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后的一种系统生物学［5］。通过考察生物机体受刺激或扰动后代谢产物的变化，揭示机体生命代谢活动本质的科学，有利于指导疾病的防治。目前最常用的分析手段包括：1H核磁共振（1H NMR）、气相色谱和质谱联用（GC/MS），液相色谱和质谱联用（LC/MS）及傅里叶变换红外光谱与质谱联用（FTIR/MS）等［6］。目前，代谢组学已开始用于某些慢性气道疾病的研究，如囊性肺纤维化病、哮喘及气道生物膜的研究［7］，有助于对疾病严重程度及细菌生物膜的鉴别。但是，至今尚未见 COPD急性加重相关的代谢组学研究报道。

本研究对 COPD 急性加重和稳定期血清的1H NMR谱图及模式识别分析，结果显示，COPD急性加重期与稳定期血清样本之间存在显著的特征性差异代谢物。急性加重期血清3-羟基丁酸、赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨和丙酮酸水平等明显升高，而缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、VLDL及LDL等脂类水平明显下降。

急性加重组血清3-羟基丁酸和丙酮酸等水平明显升高，说明存在明显的能量代谢紊乱。3-羟基丁酸是人体脂肪酸代谢后产生的3种酮体之一，通常人体血液和组织中浓度约0.1mmol/L，在葡萄糖饥饿情况下可以作为脑部的一种应急性能源使用，3-羟基丁酸与体内能量代谢紊乱等有着密切联系。丙酮酸为整个生物体基本代谢的中间产物之一，可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。

急性加重组血清谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺水平升高，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸水平显著下降，说明COPD急性加重期蛋白质代谢紊乱。亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸三种支链氨基酸均为必需氨基酸，可以有效防止肌肉损失，因为其能够更快地分解转化为葡萄糖，给身体组织提供能量，有助于调节血糖水平。这三种氨基酸水平下降说明摄入减少，引起呼吸肌功能下降，促进诱发COPD急性加重的发作。另外，急性加重组血清VLDL和LDL等脂类水平明显下降，说明COPD急性加重患者体内存在明显的脂类代谢异常。

［1］ 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组．慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)．中华结核和呼吸杂志,2013, 36(4): 255-264．

［2］ Global strategy for the diagnosis, management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease(updated 2013)［EB/ OL］．http://www．goldcopd．org/guidelines-global-strategyfor=diagnosis-management．html．

［3］ Vestbo J, Hurd SS, Agustí AG, et al． Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD Executive Summary．Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187(4):347-365．

［4］ Stanciole AE, Ortegón M, Chisholm D, et al． Cost effectiveness of strategies to combat chronic obstructive pulmonary disease and asthma in sub-Saharan Africa and South East Asia: mathematical modelling study．BMJ, 2012, 344:e608．

［5］ Nicholson JK, Lindon JC．Systems biology: metabonomics．Nature, 2008, 455(7216):1054-1056．

［6］ Koek MM, Jellema RH, van der Greef J, et al． Quantitative metabolomics based on gas chromatography mass spectrometry: status and perspectives．Metabolomics, 2011, 7(3): 307-328．

［7］ Robroeks CM, Berkel JJ, Dallinga JW, et al． Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls．Pediatric Research, 2010, 68(1):75-80．

Objective To explore the serum characteristic metabolites in acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease（COPD）by using of1H nuclear magnetic resonance（1H NMR）based metabonomics. Methods 31 COPD in-patients with acute exacerbation were included in this study. Fasting blood samples were taken from COPD patients with acute exacerbation within 24 hours after admission（acute exacerbation group）and after their entrance to stable stage after routine treatment（stable stage group），respectively. Serum samples were stored in -80℃ refrigerator after blood centrifugation. One-dimensional hydrogen proton spectra of serum samples from two groups were measured by using highresolution1H NMR，and the score values of which were analyzed by principal component analysis（PCA）and partial least square-discriminant analysis（PLS-DA）by using SIMCA-P+ software，in order to identify if there is difference in the serum metabolites between two groups. Then orthogonal partial least square-discriminant analysis（OPLS-DA）was used to judge the characteristic metabolite components between two groups. Results PCA and PLS-DA showed that there were differences between serum metabolites and associated scores between two groups，despite partial crossover，receiver operating characteristic curve analysis showed that model was reliable. OPLS-DA indicated that the serum levels of 3-hydroxybutyrate，lysine，glutamate，glutamine and pyruvic acid were significantly increased（P＜0.05），whereas serum levels of leucine，isoleusine，very low-density lipoprotein（VLDL）and low-density lipoprotein（LDL）were signifcantly decreased（P＜0.05）in acute exacerbation group，as compared to stable stage group. Obvious disturbance of energy，protein and lipid metabolism existed in acute exacerbation of COPD，as compare with those in stable stage group. Conclusions Acute exacerbation of COPD was associated with obvious disturbance in energy，protein and lipid metabolism. This conclusion needs to be proven by performing larger sample trials.

Chronic obstructive pulmonary disease Acute exacerbation Characteristic metabolite1H nuclear magnetic resonance Metabonomics

浙江省医药卫生一般研究项目（2014KYB276）；浙江省中医药科研基金项目（2014ZA112）

310012 浙江省立同德医院呼吸内科（杨秀云 黄飞华吴美倩）

314300 浙江省立同德医院海盐分院呼吸内科（张永建王晓平）

200331 上海天佑医院重症医学科（杨中良）

*通信作者