缺氧抑制RABEP1基因表达对肾癌细胞786-O凋亡及增殖的影响

郭 勇 彭龙开⋆

缺氧抑制RABEP1基因表达对肾癌细胞786-O凋亡及增殖的影响

郭 勇 彭龙开⋆

目的 探讨缺氧对RABEP1表达水平的影响及其表达情况对肾癌细胞786-O增殖及凋亡能力的影响。方法 常氧及缺氧条件下培养人肾癌细胞786-O，荧光定量RT-PCR及蛋白印迹法检测RABEP1的表达情况；在缺氧条件下过表达RABEP1基因，MTT实验及Hoechst实验检测786-O细胞的增殖及凋亡情况。结果 相对常氧培养的786-O细胞，缺氧可抑制细胞内RABEP1 mRNA及蛋白的表达水平，p值分别为0.0015及0.008；在第3、4及5天，相对786-OMOCK细胞，缺氧条件下786-OpcDNA-RABEP1细胞的增殖能力明显减弱，P值均＜0.001；同样，相对786-OMOCK细胞，缺氧条件下786-OpcDNA-RABEP1细胞的凋亡明显增加。结论 缺氧可抑制Rabaptin-5的表达，缺氧环境下过表达Rabaptin-5可抑制肾癌细胞的增殖并促进细胞凋亡。

肾细胞癌 增殖 凋亡 缺氧 RABEP1

肾癌的发病率在我国泌尿生殖系统肿瘤中占第二位，仅次于膀胱肿瘤。肾腺癌（renal cell carcinoma，RCC）占肾癌的80%～90%，为起源于肾实质泌尿小管上皮细胞的恶性肿瘤［1］。随着以手术为首选治疗的综合治理方案在临床中广泛应用，肾癌的预后得以明显改善。肿瘤的侵犯及转移情况是影响5年生存率的关键因素，肿瘤局限在肾内可达92%，合并周围淋巴转移则下降至65%，一旦出现远处转移则为12%［2］。研究证明，缺氧是RCC生长微环境的重要特点，缺氧诱导的HIF可调控下游基因的转录，进而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移、血管生成及能量代谢等［3］。故研究缺氧调节的基因能为防治肾细胞癌提供理论依据，为临床治疗提供可能的靶标。研究报道，缺氧可抑制RABEP1表达，进而降低Rab5介导的内体融合，通过调节细胞凋亡、增殖及侵袭转移的信号通路，影响肿瘤的发生发展［4-5］。但是，目前尚未见缺氧调节RABEP1基因表达对肾癌细胞增殖与凋亡影响的相关报道。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及缺氧处理 人肾腺癌细胞786-O培养于含10%胎牛血清、青霉素（100U/ml）及链霉素（100U/ ml）的RPMI 1640 培养基中，常氧培养条件： 37℃、20% 氧气、5%二氧化碳、75% 氮气。缺氧培养条件：37℃、1% 氧气、5%二氧化碳、94%氮气（乏氧培养箱提供缺氧细胞培养的条件）。

1.2 荧光定量RT-PCR 将对数生长期的786-O细胞按照上述的缺氧诱导条件处理，使用omega公司一步法RNA抽提试剂盒提取总RNA，具体参照说明书；酶标仪法测定RNA的纯度，反转录后按SYBR Green法进行RT-PCR，参照TAKARA说明书。β-actin 做为定量计算RABEP1 表达水平的内参基因，用2-△△CT法进行相对定量计算。引物序列为： RABEP1（human），sense，5'- TCGTGACTATGAGCACCAGTT-3'，5'-ATCACAACGGACCGAAGTTTC-3'；β-actin（human），sense，5'-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3'，antisense 5'- GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3'。

1.3 蛋白印迹法（Western blot） 采用强裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，总上样量为50μg，采用流程为：电泳（恒压100V，90min）、转膜（湿转，恒压120V，90min）、封闭（5%脱脂奶粉的TBST，常温2h）、孵育一抗（4℃，过夜）、洗膜（5min×3次）、孵育二抗（常温，2h）、洗膜（10min×3次）、ECL显色。（RABEP1，1：500；β-actin，1：1000，英国Abcam公司）。

1.4 过表达RABEP1基因 6孔中接种细胞悬液，培养箱培养，待目的细胞融合度达约30%，加入空载体及慢病毒pcDNA-RABEP1进行转染，具体参照制造商的协议。利用蛋白印迹法检测转染的情况。过表达慢病毒pcDNA-RABEP1购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.5 MTT检测细胞增殖活力 接种上述细胞至96孔板，放进37℃ 5%CO2乏氧细胞培养箱中培养。从铺板的第2天开始，培养终止前4h每孔加MTT溶液，继续孵育4h，终止培养。每孔加100μl DMSO，振荡10min。选择490nm，在酶标仪上测定各孔光吸收值。计算方法：以day1～day5相对day1的OD490比值定义为OD490/fold（表示各天的增殖倍数），并绘制细胞相对活力曲线。

1.6 Hoechst检测细胞的凋亡 利用玻璃片制作单层细胞爬片，以1%盐酸-70%乙醇溶液浸泡固定5min，PBS漂洗5min，Hoechst 33258工作液对细胞进行染色，室温15min，漂洗3次，5min/次，用甘油与PBS比例为1：9的混合液封片，室温下晾干，在荧光显微镜下观察，并随机拍照荧光显微镜观察。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧抑制RABEP1的表达 荧光定量RT-PCR 及Western blot结果显示，在786-O细胞缺氧48h培养后，RABEP1mRNA及蛋白的表达水平均明显下降，P值分别为0.0015及0.0080，见图1。

图1 缺氧对RABEP1 mRNA及蛋白表达的影响

2.2 检测pcDNA-RABEP1感染786-O细胞的情况 Western blot检测缺氧条件下pcDNA-RABEP1感染786-O细胞36h后RABEP1蛋白的表达情况，发现pcDNA-RABEP1能明显提高目标蛋白分子的表达量，与空载组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.3 过表达RABEP1后细胞增殖活力 786-O 、 786-OMOCK及786-OpcDNA-RABEP1在缺氧情况下进行培养，连续5d利用MTT法检测细胞的增殖活力。结果显示：786-OpcDNA-RABEP1的增殖能力明显受限，尤其在转染pcDNA-RABEP1后第3、4、5天细胞增殖能力减弱明显，P值均＜0.001，见图3-A。

2.4 过表达RABEP1后细胞的凋亡情况 786-O 、786-OMOCK及786-OpcDNA-RABEP1在缺氧情况下进行培养，786-O组及786-OMOCK组细胞的核呈均匀的蓝色荧光，786-OpcDNA-RABEP1的细胞核呈凋亡状态，即染色质固缩及核碎裂，细胞质则浓缩，呈明亮的蓝色。可见过表达RABEP1后呈凋亡状态的细胞数增加，可判断缺氧状态下过表达RABEP1基因使786-O细胞的凋亡增加，见图3-B。

图2 pcDNA-RABEP1感染786-O细胞后RABEP1蛋白的表达量

图3 缺氧情况下分别培养786-O、786-OMOCK及786-OpcDNA-

3 讨论

RABEP1，又名Rabaptin-5及Neurocrescin，作为蛋白编码基因，位于17p13.2，其蛋白分子量约99kD。RABEP1蛋白主要分布在胞浆、细胞膜和内体上，其C端存在两个连续结构域CC1及CC2，作为Rab的功能蛋白，可通过连接γ-adaptin，RAB4A 及RAB5A，促进膜融合而介导囊泡转运、早期内体融合及膜内吞的作用。研究证明，RABEP1受 Caspase-3信号通路的特异性调控［5］，在机体细胞内保存适当的表达水平，进而调节EGFR等生长及凋亡相关因子的表达及活性水平，进一步影响下游信号通路活性，对维持组织内环境稳定及细胞的生物学功能起重要作用。反之，当机体细胞受体外内环境因素刺激，调控Rabaptin-5表达的机制失平衡，则可导致恶性肿瘤的发生及发展。有研究者利用qRT-PCR芯片对乳腺癌mRNA进行高通量分析，发现RABEP1在癌组织中高表达且是患者复发的危险因素［6］。研究发现，HDAC6基因在胃癌细胞内通过抑制Rabaptin-5介导的初级内体融合而延长EGFR活性，最终可增强恶性细胞的致瘤性［7］。也有研究发现，PKD可促进Rabaptin-5的磷酸化，导致后者与Rab4结合，进而减慢PDGF驱动的Integrin循环再生，最终抑制乳腺癌细胞的侵袭转移［8］。总之，Rabaptin-5作为肿瘤发生及进展的关键负性调节因子，故进一步研究调节Rabaptin-5表达的相关因素对防治肾癌有重要科学意义。

缺氧不仅是所有实体恶性肿瘤的重要微环境特征之一，亦是肿瘤生物学行为进化的诱发因素。临床上常采用栓塞肿瘤滋养血管的方法来治疗实体瘤，如肝细胞癌及肾癌等。已有基础及临床研究均证明，肿瘤组织的缺氧状态是患者预后的危险因素。缺氧致肿瘤细胞生物学行为进化的主要机制是通过诱导恶性细胞的遗传不稳定性、筛选缺乏凋亡能力的细胞及调控多类参与肿瘤细胞发生发展的基因和蛋白表达有关。缺氧可诱导HIF-1α基因的表达，而HIF-1α作为唯一在特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子，不仅能够上调多种基因的转录活性，同时亦可抑制基因的转录活性，参与调控恶性细胞增殖、凋亡、侵袭转移、能量代谢及免疫等生物学行为。

研究发现，细胞在缺氧状态下，HIF-1α可抑制Rabaptin-5的表达，而抑制细胞的膜内吞作用［4］。Wang Y等［9］研究显示，在缺氧环境中培养肾细胞癌，Rabaptin-5的表达水平明显受抑制，与本资料结果基本一致。与此同时，为进一步分析Rabaptin-5对缺氧环境下肾癌细增殖及凋亡的影响，作者选择肾癌细胞在缺氧环境进行培养，通过在肾癌细胞内表达Rabaptin-5基因，观察细胞的增殖活性及凋亡情况。本资料结果显示，在缺氧环境中过表达Rabaptin-5，可以显著抑制786-O细胞的增殖、并促进786-O细胞的凋亡，此结果亦是对Michael Ohh等研究结果的进一步补充。结合既往文献报道，推测缺氧环境下Rabaptin-5可调节肾癌细胞增殖及凋亡的可能机制如下：缺氧诱导HIF-1α的表达，进而抑制Rabaptin-5基因的转录及蛋白的合成，使Rab4或Rab5驱动的膜内吞行为减弱，进一步导致细胞膜上调节细胞生长、凋亡、迁徙及侵袭转移相关受体的内吞减少而受体下游信号通路持续激活，这些受体包括EGFR、FGFR及VEGFR等。

综上所述，本研究再次明确了缺氧可抑制肾癌细胞内Rabaptin-5的表达，同时探明缺氧环境下过表达Rabaptin-5可抑制肾癌细胞的增殖并促进细胞凋亡。但是，为进一步探明Rabaptin-5对肾癌细胞更多生物学行为的影响，需进一步实验。同时，需纳入临床病例，探明Rabaptin-5表达水平的临床病理意义，为实现针对肾癌以Rabaptin-5为防治靶标提供理论依据。

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［3］ Shen C, Kaelin WG Jr． The VHL/HIF axis in clear cell renal carcinoma． Semin Cancer Biol, 2013, 23(1): 18-25．

［4］ Troilo A, Alexander I, Muehl S, et al． HIF1alpha deubiquitination by USP8 is essential for ciliogenesis in normoxia． EMBO Rep, 2014, 15(1): 77-85．

［5］ Swanton E, Bishop N, Woodman P． Human rabaptin-5 is selectively cleaved by caspase-3 during apoptosis． J Biol Chem, 1999, 274(53): 37583-37590．

［6］ Andres SA, Brock GN, Wittliff JL． Interrogating differences in expression of targeted gene sets to predict breast cancer outcome．BMC Cancer, 2013, 13: 326．

［7］ Park SJ, Kim JK, Bae HJ, et al． HDAC6 sustains growth stimulation by prolonging the activation of EGF receptor through the inhibition of rabaptin-5-mediated early endosome fusion in gastric cancer．Cancer Lett, 2014, 354(1): 97-106．

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Objective To explore the expression of RABEP1 in human renal cancer cell 786-O and investigate the influence of RABEP1 expression on proliferation and apoptosis under hypoxia. Methods The human renal cancer cell 786-O was cultured in normoxic and hypoxic condition. The mRNA and protein levels of RABEP1were detected by qRT-PCR and Western blot.The 786-O cell with ectopic expression of RABEP1 was cultured under hypoxia，and MTT and Hoechst tests were applied to investigate proliferation and apoptosis ability of 786-O cell. Results Compared to 786-O cell under normoxia，RABEP1 mRNA and protein expression level were down-regulated under hypoxia，P=0.0015 and 0.008，respectively. Compared to 786-OMOCK under hypoxia from day 3 to day 5，proliferation ability of 786-OpcDNA-RABEP1 cell was inhibited under hypoxia，all the p values were less than 0.001. Then，Compared to 786-OMOCK under hypoxia，apoptosis ability of 786-OpcDNA-RABEP1 cell was enhanced under hypoxia. Conclusions Hypoxia could inhibit RABEP1 expression，and ectopic expression of RABEP1 could suppress proliferation and enhance apoptosis of human renal cancer 786-O under hypoxia.

Human renal cancer cell Proliferation Apoptosis Hypoxia RABEP1

410011 中南大学湘雅二医院泌外器官移植科

*通信作者