IL-4及IL-9在D-IBS患者外周血中的表达及其与肠道MC活化的关系

沈敏瑾

IL-4及IL-9在D-IBS患者外周血中的表达及其与肠道MC活化的关系

沈敏瑾

目的 通过入组腹泻性肠易激综合征（D-IBS）患者，观察外周血中IL-4及IL-9的表达及肠道肥大细胞（MC）活化情况。方法 依据罗马III诊断标准入选D-IBS患者30例，健康对照组30例，采用甲苯胺蓝染色法计数回盲部结肠黏膜MC，ELISA法检测血清中IL-4、IL-9表达。结果 与正常对照组比较，IBS患者MC数量增多（4.43±0.21 vs 2.12±0.27）（P＜0.05），黏膜IL-4及血清IL-9的表达均高于对照组（42.76±5.71 vs 21.19±6.17，30.43±7.45 vs 26.74±5.12）（P＜0.05）。结论 D-IBS患者血清中存在IL-4、IL-9的表达升高，其可能通过促进MC活化脱颗粒，从而引起IBS临床症状。

肠易激综合征 肥大细胞 白介素4 白介素9

肠易激综合征（IBS）是最常见的功能性胃肠病，全球范围内IBS发病率波动在3.3%～31.6%，目前亚洲国家IBS发病率已达9.6%［1］。据临床表现，IBS可进一步分为腹泻型、便秘型及混合型，其中以腹泻型居多。内脏高敏感是IBS症状产生的主要原因，但其具体产生机制至今尚未清楚阐明。目前，肥大细胞（MC）在IBS中的重要作用已被肯定［2］，白介素4（IL-4）及白介素9（IL-9）与MC活化密切相关，但是其在IBS中的相关研究较少。在本研究中，作者通过检测腹泻型IBS（D-IBS）患者与健康人群外周血中IL-4及IL-9表达水平及肠道MC活化情况，拟初步探讨IL-4及IL-9介导MC活化在IBS发病中的作用。

1 临床资料

1.1 一般资料 2015年6月至12月在本院消化科住院及门诊就诊的D-IBS患者30例（观察组），其中男13例，女17例，平均年龄（43.2±12.6）岁。均符合罗马III中D-IBS诊断标准［3］：反复发作腹痛或腹部不适，且近3个月内≥3d/1个月，且伴有以下≥2条：排便后缓解；发作时伴排便次数的改变；发作时伴排便性状的改变。诊断前症状出现≥6个月，最近3个月有典型的症状发作。D-IBS亚型：稀/水样便＞25%，且块状/硬便＜25%。须经肠镜等检查排除引起这些症状的器质性疾病。所有患者需排除任何已知的食物不耐受，吸收不良，有胃肠道手术史，器质性胃肠道疾病当前诊断或病史。选取同期健康体检者30例（对照组），其中男12例，女18例，平均年龄（40.2±14.1）岁。所有患者均签署知情同意书。两组性别、年龄及BMI各亚型之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 （1）标本采集：收集D-IBS患者及健康对照者空腹静脉血5ml，2500r/min，离心5min。分离血清后置于-80℃冰箱保存备用。肠镜检查中获取回盲部活检组织2块，用生理盐水清洗干净，分别浸泡入10%中性福尔马林中或液氮中。（2）血清IL-4及IL-9检测：采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清IL-4及IL-9表达，人IL-4试剂盒购自美国eBioscience公司，人IL-9试剂盒购自美国GUSABIO公司，操作严格按照说明书进行，在0孔内加入100μl标准稀释液，留3孔不加为空白孔。标准孔内加入标准品50μl/孔。试验孔内加入生物素标记的抗IL-4或抗IL-9 50μl/孔，室温孵育2h，洗板3次。加入链霉素标记的HRP工作液100μl/孔，室温孵育30min，洗板3次。加入100μl色素底物液100μl/孔，孔内液体将会变为蓝色。室温避光孵育30min。加入终止液100μl/孔，缓慢混匀。孔内液体将会由蓝色变为黄色。在加入终止液2h内在酶标仪上检测各孔吸光度（OD值）。通过标准曲线作图分析计算样品浓度。（3）肠道MC甲苯胺蓝染色：采用10%中性福尔马林固定新鲜标本，系列脱水、透明后石蜡包埋，4μm连续切片，75℃烤30min，常规脱蜡至水；滴加甲苯胺蓝液反应30min；水洗，入冰醋酸液分化，至胞核和颗粒清晰；水洗，用冷风吹干；二甲苯透明，中性树胶封固。然后于显微镜下观察课件MC胞质颗粒呈红紫色，胞核呈蓝色。每个样本取随机5个高倍视野（×200），连续计数并取平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，两个样本均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血中IL-4及IL-9的表达水平比较 与对照组比较，D-IBS患者血清IL-4的表达显著升高（42.76±5.71） vs （21.19±6.17）（P＜0.05），同时，血清IL-9的表达亦上调（30.43±7.45） vs （26.74±5.12）（P＜0.05）。

2.2 回盲部MC计数比较 MC主要分布于疏松结缔组织，外形多呈椭圆形，胞核蓝色，胞质内可见紫红色颗粒，部分可见胞内颗粒释放现象（见图1）。与正常对照组比较，D-IBS患者MC数量明显增多（4.43±0.21） vs （2.12±0.27）（P＜0.05）。

图1 两组MC HE染色图

3 讨论

肠道MC活化是IBS人群重要特征之一［4］，研究发现，在IBS人群中，小肠及大肠MC分布均增多，进一步研究发现，MC的分布受性别［5］、不同肠段［6］及IBS亚型影响，其中，与便秘型IBS比较，D-IBS患者肠道MC分布更多［7-8］。MC活化后可以脱颗粒释放一系列炎症因子，如蛋白酶、前列腺素、组胺、细胞因子等，研究发现，IBS患者肠道中MC分布更靠近肠神经末梢，并且与内脏痛觉过敏密切相关［9］。进一步研究发现，MC释放的相关物质可以活化肠神经元［10］，其中，多种细胞因子，如IL-6、IL-8、TNF-α等可以调控肠道动力及肠道感觉神经元，参与IBS症状的产生［11］。在本研究中，D-IBS患者回盲部MC数量增多，与前期研究结果一致。

多种途径参与介导MC活化，一般认为，当MC偶联交联有特异性抗原的IgE/IgG，或者游离免疫球蛋白轻链（IgFLC）后，自身可以被激活。此外，MC的活化尚与包括补体、神经递质、激素等在内多种物质有关。在IBS发病中，研究认为，来源于肠腔的食物抗原、致病菌等可以通过经典途径引起MC活化［12］，而中枢应激则主要通过释放CRF参与介导MC活化。除此之外，已证实多种细胞因子与MC活化有关，但是其在IBS发病中的作用尚不清楚。

IL-4与MC的活化密切相关：IL-4的表达上调可以引起抗原特异性IgE产生，从而导致MC活化。目前，有关IBS外周血IL-4表达情况的相关临床研究较少，有研究认为，作为TH2类细胞因子，IL-4在IBS患者外周血表达与正常对照组比较无明显变化，然而，在基础研究方面，有文献报道，采用旋毛虫灌胃构建感染后肠易激综合征（PI-IBS）小鼠模型并检测肠道中IL-4的表达，结果发现其在肠道急性感染期表达上调，而随后表达恢复正常甚至降低，提示IL-4通过活化MC可能在IBS早期发挥作用。此外，近期有研究发现，肠道中树突状细胞活化可以通过刺激T淋巴细胞分泌IL-4，其可能通过活化MC参与IBS大鼠内脏高敏感的产生。在本研究中，D-IBD患者肠道中存在MC数量增多，同时伴随有外周血表达IL-4上调，提示IL-4通过活化MC可能在IBS的发生中发挥重要作用。

IL-9最初被认为是一种T淋巴细胞生长因子，从其细胞来源分析，包括Th2类细胞、Th9细胞、Th17细胞、Treg细胞及其MC等在内的多种细胞均可以分泌IL-9，其中，MC是分泌IL-9的主要细胞类型，其可以通过自分泌的形式增加MC表面FceRIα的表达，促进细胞表面IgE交联，启动下游信号，从而引起MC活化并脱颗粒释放组胺等炎性介质，形成正反馈进一步促进IL-9分泌，从而促进免疫应答中MC的生长和增殖。目前，有关IL-9与IBS关系目前未见报道，本研究发现，D-IBS患者外周血中IL-9表达显著升高，并且伴随有肠道MC数量增加，提示D-IBS患者中，可能存在IL-9-MC-IL-9的正反馈调节方式，IL-9本身是引起MC活化的主要因子，而MC活化后，又进一步促进IL-9的分泌。

综上所述，D-IBS患者外周血IL-4及IL-9表达上调，并伴随有肠道MC数量增多，提示IL-4及IL-9介导的MC活化可能在D-IBS发病中发挥重要作用。当然，本研究尚存在的不足之处：仅观察D-IBS患者外周血中IL-4及IL-9的表达水平，而肠黏膜中相关细胞因子的表达变化并未检测，且其对象仅为D-IBS患者，MC相关细胞因子在IBS其他亚型中的表达变化尚需要更深入的研究进行探讨。

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Objective To investigate the level of serum IL-4 and IL-9 in D-IBS patients as well as the number of MC in colon. Methods 30 D-IBS patients according to Rome III diagnostic criteria were enrolled in the study，and 30 healthy individuals as a normal control. Toluidine blue staining was used to determine the number of mast cells（MCs）. Expression of IL-4 and IL-9 in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Results The number of colonic MC in D-IBS group was more than that in control group（4.43±0.21vs2.12±0.27）（P＜0.05）. Expression of serum IL-4 and IL-9 in D-IBS group were higher than that in control group（42.76±5.71 vs21.19±6.17，30.43±7.45 vs26.74±5.12）（P＜0.05）.Conclusions The hypothesis was supported that the increased expression of serum IL-4 and IL-9 may lead to mast cells degranulation，which resulting in the clinical symptoms of D-IBS.

Irritable bowel syndrome Mast cell Interleukin-4 Interleukin-9

321000 浙江省金华市中心医院消化科