棒曲霉素对人肝细胞L-02的毒性效应及作用机制

苏 楠，马丽卿，马永成，岳晓禹

（1.河南牧业经济学院食品工程学院，河南郑州 450011；2.郑州大学人民医院临床药理室，河南 郑州 450003）

棒曲霉素对人肝细胞L-02的毒性效应及作用机制

苏 楠1，马丽卿1，马永成2，岳晓禹1

（1.河南牧业经济学院食品工程学院，河南郑州 450011；2.郑州大学人民医院临床药理室，河南 郑州 450003）

目的研究棒曲霉素（PAT）对人肝细胞L-02的毒性作用，并探讨其作用的分子机制。方法PAT 1.25，2.5，5，10和20 μmol·L-1分别作用于L-02细胞24和48 h，采用噻唑蓝（MTT）法检测PAT对L-02细胞增殖的抑制作用；PAT 0，5和10 μmol·L-1作用L-02细胞24 h后，Hoechst33258和JC-1染色，通过荧光显微镜进行细胞形态及线粒体膜电位（MMP）观察；利用流式细胞术对细胞凋亡、MMP及细胞内活性氧（ROS）水平进行定量分析；Western蛋白印迹法检测PAT对线粒体凋亡通路的影响。结果PAT明显抑制L-02细胞的生长，24和48 h的IC50值分别为6.61和2.78 μmol·L-1；与正常对照组低MMP比率（9.2±2.3）%相比，PAT 5和10 μmol·L-1组低MMP比率显著升高（P<0.01），分别升高至（23.4±4.5）%和（47.1±5.5）%；PAT 5和10 μmol·L-1处理后L-02细胞早期凋亡率较正常对照组（3.8±1.1）%升高（P<0.01），分别增至（29.8±4.5）%和（24.1±6.2）%；PAT引起L-02细胞内ROS增加，使用外源性谷胱甘肽预孵育细胞后，阻断了PAT诱导的ROS升高和增殖抑制的作用。结论PAT可显著影响L-02的生长，并通过线粒体途径诱导细胞凋亡，其机制与胞内ROS水平升高有关。

棒曲霉素；细胞毒性；细胞凋亡；线粒体；活性氧

棒曲霉素（patulin，PAT）属于曲霉和青霉等真菌的次级代谢产物，普遍存在于发霉的水果、蔬菜、谷物和动物饲料中，尤其在腐烂的苹果及苹果汁、苹果酒等苹果制品中，PAT的含量最高。PAT的主要接触途径是消化道，经消化道吸收进入血液循环，分布于全身各个组织器官，在细胞色素P450酶作用下其毒性有所下降，但代谢产物仍具有毒性［1-2］。体外实验表明，PAT可诱导多种菌株的基因突变、对体外培养的细胞亦有DNA损伤作用；动物实验研究也发现，PAT对胃肠、肝肾及免疫系统具有明显毒性。因此，WHO和欧盟已将果汁中的PAT检测限量定为50 μg·L-1，目前FDA以及世界多个国家也对食品中PAT含量做了严格限定［3］。

虽PAT的生物毒性已明确，但多项报道指出由于常规的巴氏消毒法不能有效减少食品中PAT的含量，市场流通的商品中PAT超标的情况仍较多见，严重威胁着人们的健康［4］。目前针对食品中PAT的检测技术研究较多［5］，且应用相对成熟，但对于PAT的毒理研究不足。因此，本研究以人正常肝细胞L-02为实验模型，评估PAT的细胞毒性，探讨可能的毒性机制，为进一步了解其对人类潜在的危害提供实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂和主要仪器

人肝细胞L-02购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；细胞培养液RPMI 1640（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；PAT（P1639）、噻唑蓝（MTT，M2128）及Hoechst33258（B2883）（美国Sigma公司）；FITC-AnnexinⅤ/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（K201-25）（美国Biovision公司）；细胞线粒体分离试剂盒（C3601）、JC-1荧光染料（C2005）、荧光探针2′7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′7′-dichlorodihydroflu-orescein diace⁃tate，DCFH-DA）（S0033）（碧云天生物技术研究所）；鼠抗人细胞色素c单克隆抗体（sc-13156，15 ku）（美国Santa Cruz公司）；GAPDH抗体（AB-PR001）（杭州贤至生物科技公司）；辣根过氧化酶标记的二抗（北京中杉金桥生物技术公司）；谷胱甘肽（glutathione，GSH，A600229）（上海生工生物公司）。

311型细胞培养箱（美国Thermo公司）；sw-cj-1f超净工作台（苏州净化设备有限公司）；FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；5424R高速低温离心机（德国Eppendorf公司）；80i荧光显微镜（日本Nikon公司）；Powerwave XS酶标仪（美国Bio Tek公司）；MiniVE电泳电转系统（美国GE公司）；ME104分析天平（瑞士梅特勒托利公司）。

1.2细胞培养

使用RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清，青霉素100 kU·L-1和链霉素100 g·L-1），于37℃，5% CO2细胞培养箱内培养L-02细胞。待细胞生长至大约70%满时，胰酶消化，传代。选用对数生长期且状态良好的细胞用于实验。

1.3MTT法检测细胞存活率

胰酶消化，离心收集细胞，使用新鲜培养基调整细胞浓度，按每孔约7000细胞接种于96孔板，边缘孔用无菌PBS填充。置培养箱过夜培养，待细胞充分贴壁，使用或不使用GSH预孵育细胞后，加入终浓度为1.25，2.5，5，10和20 μmol·L-1的PAT，每个浓度设6个复孔。PAT分别作用24和48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，继续孵育4 h后终止培养，移液器吸去孔内培养液，每孔加入150 μL二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），于摇床低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪测定490 nm处的吸光度（A490nm）。按照以下公式计算细胞存活率，细胞存活率（%）=处理组（A490nm）/正常对照组（A490nm）×100%。并使用GraphPad Prism软件计算IC50值。

1.4倒置荧光显微镜检测细胞形态

于6孔板中做细胞爬片，使用PAT 5和10 μmol·L-1作用细胞24 h后，使用免疫染色固定液室温固定10 min。加入适量的Hoechst33258染液进行细胞染色，室温避光30 min。倒掉染液，PBS漂洗2次，荧光显微镜观察并拍照。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡

PAT 5和10 μmol·L-1作用细胞24 h后，按照FITC-AnnexinⅤ/PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。先加入适量结合缓冲液，然后加入FITC标记的AnnexinⅤ和PI，室温避光孵育5 min，使用流式细胞仪分析早期凋亡的细胞。

1.6JC-1染色检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）［6］

将细胞在6孔板中制成爬片，使用PAT 5和10 μmol·L-1分别作用细胞24 h后，弃去培养基，加入JC-1染液（线粒体荧光探针，10 mg·L-1），在细胞培养箱中孵育20 min，使用荧光显微镜在488 nm激发波长下观察并拍照。同样，药物作用24 h后离心收集细胞并进行上述染色操作后，使用流式细胞仪分析细胞MMP的变化情况，结果使用FlowJo软件进行数据处理。

1.7Western蛋白印迹法检测细胞色素c

参考马永成等［7］的方法，按线粒体分离试剂盒说明书，分离线粒体，提取线粒体蛋白和细胞质蛋白。BCA法测定蛋白浓度，取60 μg总蛋白上样，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）后，转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗室温孵育2 h或4℃孵育过夜，辣根过氧化酶标记的二抗室温下孵育2 h，充分洗膜后加增强化学发光（enhanced chemilumines⁃cence，ECL）剂，暗室中对胶片曝光，扫描并保存结果。扫描条带计算积分吸光度值（integrated absor⁃bance，IA），蛋白相对表达水平以目标蛋白IA与内标IA的比值表示。

1.8荧光探针DCFH-DA流式法检测活性氧水平

使用氧化还原敏感探针DCFH-DA检测胞内ROS的水平，细胞内的ROS可氧化无荧光的DCFH-DA生成有荧光的二氯荧光素（2′7′-dichlo⁃rodihydrofluorescein dictate，DCF），从而通过DCF的荧光强度判别细胞内ROS的水平。细胞处理后，胰酶消化离心收集细胞，PBS洗2次，使用无血清配制的10 μmol·L-1的DCFH-DA 37℃孵育30 min。再使用无血清培养基洗细胞3次，以去除未结合的游离探针，流式检测ROS的变化情况。

1.9统计学分析

实验结果数据以x±s的形式表示，采用SPSS 15.0软件进行统计分析，用t检验检测各组间的差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1棒曲霉素对L-02存活的影响

如图1所示，PAT对人肝细胞L-02生长有显著的抑制作用，且呈浓度和时间依赖性（24 h，r2=0.95，P<0.01；48 h，r2=0.99，P<0.01）；由浓度-效应曲线计算24和48 h时PAT对L-02细胞的IC50值分别为6.6和2.8 μmol·L-1。

Fig.1 Effect of patulin（PAT）on viability of L-02 cells by MTT assay.x±s，n=3.

2.2棒曲霉素对L-02细胞凋亡的影响

Fig.2 Effect of PAT for 24 h on apoptosis of L-02 cells by Hoechst33258 staining（×200）.Arrows indicate apoptotic cells.

PAT作用L-02细胞24 h后，正常对照组细胞核大小均匀，染色质无浓缩。而PAT组细胞可见染色质浓缩，边缘化，核膜裂解，染色质碎裂成块状，形成凋亡小体等典型凋亡状态（图2）；AnnexinⅤ-FITC/PI双染，流式细胞术检测发现，PAT 5和10 μmol·L-1组的早期凋亡率较正常对照组（3.8±1.1）%显著升高（P<0.01），分别增至（29.8±4.5）%和（24.1± 6.2）%；晚期凋亡率由正常对照组的（1.8±0.3）%增至（6.0±3.1）%（P<0.05）和（25.6±5.5）%（P<0.01）（图3）。上述结果表明，PAT可诱导L-02细胞凋亡。

Fig.3 Effect of PAT for 24 h on apoptosis of L-02 cells by flow cytometry.B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=3.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control（0 μmol·L-1）group.

2.3棒曲霉素对L-02细胞MMP的影响

PAT作用细胞24 h后荧光显微镜观察，可见正常对照组细胞线粒体显示强的橙色荧光，提示MMP较高，细胞状态正常；在PAT 5 μmol·L-1作用下，细胞线粒体呈现了一定量的绿色荧光，提示MMP较正常对照组有所下降；当浓度升至10 μmol·L-1时，线粒体几乎完全呈现绿色荧光，提示此浓度下MMP完全丧失，细胞死亡不可逆转（图4）。

Fig.4 Effect of for 24 h PAT on mitochondrial mem⁃brane potential(MMP)of L-02 cells by JC-1 staining（×200）.

流式分析结果表明（图5），PAT 5和10 μmol·L-1使L-02细胞MMP降低，低MMP的细胞比例由正常对照组的（9.2±2.3）%分别升高至（23.4±4.5）%和（47.1±5.5）%（P<0.01）。同时，Western蛋白印迹实验结果（图6）显示，L-02细胞经PAT作用24 h后，线粒体中的细胞色素c减少，而胞质中的细胞色素c则增多，进一步证明了PAT导致MMP下降，通透性增加，细胞色素c由线粒体释放到细胞质。这些结果表明，PAT诱导的凋亡过程与线粒体损伤有关。

Fig.5 Effect of PAT for 24 h on percent of low MMP cells by flow cytometry.B was the semi-quantitative result of A.x±s,n=3.**P<0.01,compared with normal control(0 μmol· L-1)group.

Fig.6 Effect of PAT on release of cytochrome c from mitochondria to cytosols in L-02 cells treated with PAT for 24 h by Western blotting.B was the semi-quantitative re⁃sults of A.x±s，n=3.**P<0.01，compared with nromal control（0 μmol·L-1）group.

2.4棒曲霉素对L-02细胞内ROS水平的影响

不同浓度PAT分别处理L-02细胞12 h后，装载DCFH-DA探针，流式细胞仪检测发现，L-02细胞内ROS水平显著增加（图7A），与正常对照组相比，PAT 5和10 μmol·L-1组ROS含量由正常对照组的（4.0±1.2）%分别增至（22.1±4.7）%和（32.0± 7.1）%（P<0.01）（图7B）。上述实验结果提示，PAT可诱导L-02细胞内ROS水平升高。

Fig.7 Effect of PAT for 12 h on intracellular levels of reactive oxygen species(ROS)in L-02 cells by flow cytometry.A：cells were treated with patulin at indicated doses for 12 h，followed by incubation with DCFH-DA 10 μmol·L-1for 30 min at 37℃；B was the semi-quantative result of A.x±s，n=3. **P<0.01，compared with normal control（0 μmol·L-1）group.

2.5抗氧化剂GSH对棒曲霉素诱导的ROS升高和增殖抑制的影响

图8结果表明，GSH完全阻断PAT 0 μmol·L-1诱导的ROS升高；此外，GSH也明显阻断了PAT作用L-02 24 h所诱导的细胞死亡，且差异具有显著性（图9）。这些结果表明，PAT通过消耗胞内GSH，导致抗氧化系统失衡，ROS积累，从而产生细胞毒性。

Fig.8 Effect of glutathione(GSH)on PAT induced ROS increase by flow cytometer.L-02 cells were pretreated with or without GSH 3 mmol·L-1，incubated with patulin 10 μmol·L-1for 12 h，stained with DCFH-DA and then determined by flow cytometry.

Fig.9 Effect of GSH on PAT induced L-02 proliferation decrease by MTT assay.Cells were pretreated with or without GSH 3 mmol·L-1，and then incubated with the indicated doses ofpatulin for24 h.x±s，n=3.**P<0.01，compared with corresponding patulin group.

3 讨论

本研究结果表明，PAT可明显抑制L-02的生长，呈浓度和时间依赖关系。通过荧光显微镜观察发现PAT可致L-02发生典型的凋亡形态，流式细胞术分析也证明PAT可引起L-02凋亡。表明PAT对人肝细胞具有显著毒性。

在线粒体介导的凋亡通路中，线粒体膜通透性起到“开关”的作用［8］。因此，本研究检测了PAT对MMP的影响，经过JC-1荧光染色以及Western蛋白印迹实验发现，PAT导致L-02 MMP下降，引起细胞色素c释放，最终诱导L-02凋亡。表明PAT通过线粒体损伤途径发挥了其细胞毒性。

细胞内部抗氧化系统失衡，ROS积聚，是细胞凋亡、组织衰老及损伤的起始原因。多项研究已证明PAT可与细胞内含巯基的生物大分子结合，破坏氧化还原系统，造成氧化压力，诱发细胞毒性［9-10］。其中GSH是哺乳动物细胞中巯基的主要来源，是动物细胞中关键的抗氧化剂，已证明一分子PAT可与三分子GSH发生反应，破坏其抗氧化作用［2］。本研究检测了PAT对ROS产生的影响，研究发现，PAT可显著升高L-02内部的ROS水平。外源性抗氧化剂GSH几乎可完全阻断PAT诱导的ROS水平升高及细胞死亡。因此推测，消耗胞内GSH引起ROS水平升高是PAT的主要毒性机制。总之，本研究为进一步揭示PAT的毒性机制、深入研究PAT对人体肝的影响，以及为制定PAT在食品中的限量标准提供了实验依据。

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Toxicological effect and mechanism of patulin on human normal liver cells L-02

SU Nan1，MA Li-qing1，MA Yong-cheng2，YUE Xiao-yu1
（1.Food Science and Engineering College，Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450011，China；2.Clinical Pharmacology Laboratory，People′s Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450003，China）

OBJECTIVE To investigate the toxicological effect of patulin（PAT）on the growth of human normal liver cells L-02 and its possible mechanisms.METHODS After cells were treated with PAT 1.25，2.5，5，10 and 20 μmol·L-1for 24 or 48 h，cell viability was examined using MTT assay.L-02 cells were treated with PAT 5 and 10 μmol·L-1for 24 h，respectively.Cytomorphology and mitochondrial membrane potential（MMP）were observed under a fluorescence microscope.Apoptosis，MMP and reactive oxygen species（ROS）were analyzed by flow cytometry.Mitochondria apoptosis pathways were detected by Western blotting.RESULTS PAT exhibited a strong inhibitory effect on L-02 in a concentration-dependent and time-dependent manner.IC50of PAT treatment for 24 or 48 h was 6.61 and 2.78 μmol·L-1，respectively.MMP was decreased，while the percentage of low MMP cells increased from（9.2±2.3）%in controls to（23.4±4.5）%（PAT 5 μmol·L-1）and（47.1±5.5）%（PAT 10 μmol·L-1），respectively.Compared to untreated cells，the early apoptosis population increased from（3.8±1.1）% to（29.8±4.5）%（PAT 5 μmol·L-1）and（24.1±6.2）%（PAT 10 μmol·L-1）（P<0.01），respectively.Further⁃more，the accumulation of ROS was also observed.The effect of PAT on ROS and cell viabilities could be attenuated by glutathione.CONCLUSION PAT can significantly inhibit the growth of L-02 and induce apoptosis via ROS-dependent mitochondria pathways.

patulin；cytotoxicity；apoptosis；mitochondria；reactive oxygen species

s：MA Yong-cheng，E-mail：myc66881998@163.com；YUE Xiao-yu，E-mail：yuerain@163.com

R996.1

A

1000-3002-（2016）07-0741-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.006

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（U1404332）；and Program for Science&Technology Innovation Talents of Henan Province（16HASTIT017）

2016-01-07接受日期：2016-06-17）

（本文编辑：贺云霞）

国家自然科学基金（U1404332）；河南省科技创新人才支持计划（16HASTIT017）

苏 楠，女，硕士，主要从事食品药品检测及毒理学研究，E-mail：catnancy@163.com

马永成，E-mail：myc66881998@163.com；岳晓禹，E-mail：yuerain@163.com