氨磷汀对人巨核细胞白血病Dami细胞增殖及分化的影响

汪海涛，杨 波，卢学春，胡 博，杨红旗，罗龙龙，林 洁，李素霞，范 辉，乔春霞，王 巍，郎晓玲，耿 晶，黎 燕，吴晓雄，吕 明，朱宏丽

（1.中国人民解放军总医院老年血液科，北京 100853；2.军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室，北京 100850；3.中国人民解放军总医院第一附属医院血液科，北京 100048；4.北京大学肿瘤医院胸外科，北京 100142）

氨磷汀对人巨核细胞白血病Dami细胞增殖及分化的影响

汪海涛1，2，3，杨 波1，卢学春1，胡 博2，4，杨红旗1，罗龙龙2，林 洁1，李素霞1，范 辉1，乔春霞2，王 巍2，郎晓玲2，耿 晶2，黎 燕2，吴晓雄3，吕 明2，朱宏丽1

（1.中国人民解放军总医院老年血液科，北京 100853；2.军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室，北京 100850；3.中国人民解放军总医院第一附属医院血液科，北京 100048；4.北京大学肿瘤医院胸外科，北京 100142）

目的探讨氨磷汀（依硫磷酸，Amf）对人巨核细胞白血病Dami细胞分化的影响。方法Amf 0.01 ～5.0 mmol·L-1分别处理Dami细胞12 d，每天光镜下观察细胞形态，计数Dami细胞数量，绘制增殖曲线；第12天，计数直径>20 μm细胞数量，透射电镜观察Dami细胞血小板分界膜系统的形成，流式细胞仪检测细胞DNA倍体化及细胞表面抗原CD33，CD34和CD41a的变化。结果Amf 0.1 ～1.0 mmol·L-1促进Dami细胞分化；Amf>1.0 mmol·L-1时抑制Dami细胞增殖，Amf 1.0 mmol·L-1作用12 d后光镜下观察到细胞体积增大，直径>20 μm细胞比例增加24.6%（P<0.01）；透射电镜观察可见细胞出现血小板分界膜系统；流式细胞仪发现，髓系细胞分化抗原CD33表达减少13.6%；巨核细胞相关分化抗原CD41a表达增加11.9%（P< 0.05）；DNA倍体分析发现，实验组4N和8N细胞分别增至31.56%和8.83%（P<0.01），并出现16N的超多倍体细胞（3.43%）。结论Amf>1.0 mmol·L-1时抑制Dami细胞增殖，0.1 ～1.0 mmol·L-1时诱导Dami细胞向成熟巨核细胞分化。

氨磷汀；Dami细胞；细胞分化；CD41a；DNA倍体化

氨磷汀（依硫磷酸，amifostine，Amf），化学名2-（3-氨基丙胺基）-乙硫醇磷酸酯，于20世纪60年代由美国Walter Reed陆军研究所研发，用于核辐射损伤的防护。作为一种前体药物，Amf只有在细胞膜碱性磷酸酶作用下脱去磷酸基，生成游离硫醇后才有活性［1］。目前，Amf也用于减轻放化疗过程中肾、骨髓、黏膜、耳及神经系统毒性［2-4］。

临床研究发现，Amf对血细胞减少性疾病，如骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）有一定疗效，2种均有巨核细胞的病态造血或分化成熟障碍，Amf治疗后患者血小板有不同水平的升高［5-8］。这种作用并不能用Amf经典的碱性磷酸酶途径解释，我们设想Amf可能通过促进巨核细胞的分化成熟，从而对MDS和ITP等存在巨核细胞分化障碍的疾病起到治疗作用。

为了验证Amf对Dami细胞的分化作用，本研究先用不同浓度Amf诱导Dami细胞，得到Amf促进Dami细胞分化的合适浓度，然后从细胞形态学，分化抗原和DNA倍体化3个方面验证了Amf对Dami细胞分化的作用。

1 材料与方法

1.1药物、细胞、试剂和仪器

Amf，纯度>99%，大连卓悦美罗药业有限公司，4℃避光保存，每次使用时配制成液体。Dami细胞来源于美国ATCC公司，由军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室冻存。RPMI 1640培养基，美国Hyclone公司；5%戊二醛，美国Sigma公司；小鼠抗人CD41a-PE抗体（批号：340931）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）（批号：P4170），美国Santa Cruz公司；小鼠抗人CD33-PC5(批号:53199)、小鼠抗人CD34-PE抗体(批号:3569)，美国CST公司。3111型CO2培养箱，美国Thermo公司；CK40型倒置荧光显微镜，日本Olympus公司；5417R型高速离心机，德国Eppendorf公司；流式细胞仪，美国BD公司。

1.2细胞培养及增殖检测

Dami细胞在含10%加热灭活的胎牛血清和双抗的RPMI 1640培养基中呈悬浮生长，37℃，含5%CO2饱和湿度条件下培养。将细胞浓度调整为5×108L-1，于6孔板中培养，分别调整Amf浓度为0.01，0.1，1.0和5.0 mmol·L-1，每2 d传代1次，每天计Dami细胞数，连续12 d，绘制增殖曲线。

1.3光学显微镜观察细胞形态

Amf 1.0 mmol·L-1诱导Dami细胞0，4，8和12 d，于倒置显微镜下观察，随机取3个视野，记录细胞直径>20 μm的细胞数量，并照相记录。

1.4透射电镜观察细胞血小板分界膜系统形成

血小板分界膜系统由巨核细胞膜深度凹陷形成，是分割形成血小板的前提条件，也是巨核细胞成熟的标志。在Amf 1.0 mmol·L-1诱导Dami细胞第12天，取2×106细胞，5%戊二醛固定，磷酸盐缓冲液100 mmol·L-1（pH=7.2）洗1遍，四氧化锇固定后溶于环氧树脂胶，切片后进行醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察。

1.5流式细胞仪检测细胞CD33，CD34和CD41a的表达

在Amf 1.0 mmol·L-1诱导的第12天，收集约1× 106细胞于EP管，4℃预冷的PBS洗1遍，分别加入100 μL小鼠抗人CD41a/CD33/CD34抗体，枪尖吹匀，37℃避光孵育30 min；PBS洗3遍，流式细胞仪检测。

其次，政策的系统性和配套性增强。任何一个政策都不是孤立存在的，纵观四十年来养老服务政策的出台，发现养老服务政策的系统性越来越强，通常是围绕一个主题的政策会有一系列的《意见》《通知》作为支撑和配套，形成一个文件群，以文件的形式将宏观导向、发展思路、具体规定和实际做法制度化，既保证了政策的连贯性和延续性，也推动了宏观政策的具体实施和落地见效，增强了政策制度的针对性、协调性、系统性。

1.6流式细胞仪检测细胞DNA倍体化

在Amf 1.0 mmol·L-1诱导的第0，4，8和12天分别收集2×106细胞，-20℃预冷的PBS洗1遍，加入75%乙醇2 mL，-20℃固定24 h；PBS洗1遍，加RNA酶1 g·L-1100 μL，37℃避光30 min，加入PI染液0.1 g·L-1100 μL，室温避光5 min，流式细胞仪检测，Cell quest pro软件分析细胞倍体化。

1.7统计学分析

使用SPSS13.0软件包分析，计量资料用x±s表示，两组之间均数比较采用t检验，等级资料用Wilcoxon检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1氨磷汀对Dami细胞增殖的影响

增殖曲线结果显示（图1），和正常对照组相比，Amf浓度<0.01 mmol·L-1时，Dami细胞增殖不受影响；而>1.0 mmol·L-1时，Dami细胞增殖受到抑制（P<0.05）。

Fig.1 Effect of amifostine（Amf）on proliferation of Dami cells determined by cell counting.x±s，n=3.*P< 0.05，compared with normal control group.

2.2氨磷汀对Dami细胞形态的影响

Fig.2 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1on morphology of Dami cells（A）and proportion of Dami cells with diameter>20 μm（B）.See Fig.1 for the treatment.x±s，n=3. **P<0.01，compared with normal control group.

Dami细胞向巨核细胞分化过程中，细胞体积逐渐增大，并>20 μm［9］。显微镜下随机选取3个视野，计数直径>20 μm细胞的比例（图2），和正常对照组相比，Amf 1.0 mmol·L-1诱导12 d后，直径>20 μm的Dami细胞比例由0.2%增加至24.8%（P<0.01）。后续实验选用Amf 1.0 mmol·L-1诱导Dami细胞分化。

2.3氨磷汀对血小板分界膜系统形成的影响

透射电镜观察血小板分界膜系统（图3），结果显示，与正常对照细胞相比，在Amf 1.0 mmol·L-1处理第12天，电镜观察见Dami细胞胞体明显增大，直径可达约100 μm，细胞边缘不规则，呈海绵状。提示Amf能促进Dami细胞向成熟巨核细胞分化。

Fig.3 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1for 12 d on platelet demarcation membrane system in Dami cells by transmission electron microscopy.Arrows indicate the platelet demarcation membrane system.

2.4氨磷汀对Dami细胞CD33，CD34和CD41a表达的影响

Fig.4 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1for 12 d on expression of CD33（A），CD34（A）and CD41a（B）on Dami cell surface by flow cytometric analysis.C was the semi-quantitative result of A and B.x±s，n=3.*P<0.05，compared with normal control group.

流式细胞仪检测结果（图4）显示，两组Dami细胞表面CD34表达均很弱，<0.1%，未作比较。与正常对照细胞相比，Amf 1.0 mmol·L-1诱导第12天，Dami细胞表面髓系抗原CD33的表达减少13.6%（P< 0.05），而巨核细胞成熟相关抗原CD41a的表达增加11.9%（P<0.05）。

2.5氨磷汀对Dami细胞DNA倍体化的影响

细胞DNA倍体分布检测结果（图5）表明，在Amf 1.0 mmol·L-1诱导的第0天（正常对照组）以2N和4N为主，分别占62.46%和15.63%，而8N和16N细胞的比例分别占0.21%和0.02%。随着时间延长（第4，8和12天），多倍体细胞逐渐增加；在诱导第12天，与正常对照组相比，4N和8N细胞比例分别增加至31.56%和8.83%，并出现16N细胞，占3.43%（P<0.01）。

Fig.5 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1for indicated number of days on DNA ploidy in Dami cells.B was the semiquantitative result of A.x±s，n=3.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control（0 d）group.

3 讨论

本研究单独应用Amf诱导Dami细胞，发现Amf具有促进Dami细胞分化的作用。有关Amf促进巨核细胞分化作用最早由Kashiwakura等［10］报道，他们用Amf联合血小板生成素（thrombopoietin，TPO）在体外诱导胎盘及脐带血CD34+细胞向巨核细胞分化，发现和TPO组相比，巨核系祖细胞数量分别增加70倍和83倍。但他们采用Amf联合TPO诱导细胞分化，不能直接说明Amf具有促进细胞分化的作用。

本研究Dami细胞直径约在10 ～15 μm，处于原始巨核细胞阶段，在Amf处理第4天，开始出现4N细胞，同时细胞体积增大至>20 μm。在处理第12天，直径>20 μm细胞比例达24.8%，倍体在>4N细胞占43.8%，且透射电镜观察到血小板分界膜系统出现，说明Amf具有诱导Dami细胞向成熟巨核细胞分化的作用。成熟巨核细胞由造血干细胞经巨核/红系祖细胞、巨核系祖细胞、原始巨核细胞、幼巨核细胞和颗粒型巨核细胞等阶段分化而来。巨核细胞的成熟过程伴随着细胞体积及染色体倍体的增加。据报道，原始巨核细胞染色体倍体为2N，平均直径约在20 μm，而幼稚巨核细胞阶段开始出现多倍体，最多达8N，细胞直径增大至约30 μm；成熟巨核细胞（颗粒型或产板型）倍体通常>32N，细胞体积巨大，>40 μm，且出现血小板分界膜系统［9，11］。本研究Dami细胞经过Amf 1.0 mmol·L-1处理12 d后，细胞体积增大，倍体增加，并出现血小板分界膜系统，与文献［9，11］报道相符。

人红系和巨核系有着共同的祖细胞，即巨/红系祖细胞，表型为Lin-CD34+CD33+D38+IL3Rα-CD45RA-［12］，当分化为成熟巨核细胞时，细胞表面CD33和CD34的表达降低，而CD41a，CD42b，CD45和CDw32等表达升高［11，13］。其中，CD41a是巨核细胞分化成熟的特征性分子标志，在巨核细胞分化过程中始终表达，其表达强度和巨核细胞分化成熟程度相关［14］。本研究分别在Amf诱导的第0，4，8和12天，通过流式细胞仪检测Dami细胞表面CD41a表达水平，发现随着Amf处理时间延长，Dami细胞表面CD41a表达强度逐渐增加，而CD33表达强度逐渐降低，符合巨核细胞的分化规律。

本研究结果表明，Amf具有诱导Dami细胞分化的作用，但Amf促进Dami细胞分化的分子机制尚不清楚。下一步将通过基因芯片技术检测Amf处理前后Dami细胞基因表达谱差异，进一步研究Amf诱导Dami细胞分化的机制，为临床应用Amf治疗血小板生成障碍性疾病提供理论依据。

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Effect of amifostine on proliferation and differentiation of human megakaryocyte Dami cells

WANG Hai-tao1，2，3，YANG Bo1，LU Xue-chun1，HU Bo2，4，YANG Hong-qi1，LUO Long-long2，LIN Jie1，LI Su-xia1，FAN Hui1，QIAO Chun-xia2，WANG Wei2，LANG Xiao-ling2，GENG Jing2，LI Yan2，WU Xiao-xiong3，LYU Ming2，ZHU Hong-li1
（1.Department of Geriatric Hematology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China；2.Laboratory of Immunology，Institute of Basic Medical Sciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；3.Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital，Beijing 100048，China；4.Department of Thoracic Surgery，Peking University Cancer Hospital&Institute，Beijing 100142，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of amifostine（Amf）on the differentiation of human megakaryocyte cell line-Dami.METHODS Dami cells were treated with Amf 0.01-5.0 mmol·L-1for 12 d. Dami cells were counted every day for the growth curve：only cells with a diameter>20 μm.The platelet demarcation membrane system was observed by transmission electron microscopy.The expression of CD33，CD34，CD41a and DNA ploidy was detected by flow cytometry.RESULTS Amf 0.1-1.0 mmol·L-1promoted the differentiation of Dami cells，but inhibited their proliferation at a concentration>1.0 mmol·L-1. When these cells were treated with Amf 1.0 mmol·L-1for 12 d，the platelet demarcation membrane system was observed，the percentage of cells with a diameter>20 μm was increased by 24.6%（P< 0.01），the expression of CD41a was increased by 11.9%，while the expression of CD33 was decreased by 13.6%（P<0.05）.Polyploidy cells（16N）were observed，and 4N，8N and 16N cells were increased to 31.56%，8.83%and 3.43%，respectively（P<0.05）.CONCLUSION Amf 0.1-1.0 mmol·L-1can promote the differentiation of Dami cells，but inhibit their proliferation at a high concentration（>1.0 mmol·L-1）.

amifostine；Dami cells；cell differentiation；CD41a；DNA ploidy

s：ZHU Hong-li，E-mail：bjzhl202_cn@sina.com，Tel：（010）66876267；LYU Ming，E-mail：lm62033@ 163.com，Tel：（010）66931325；

R979.6，R973

A

1000-3002-（2016）07-0723-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.003

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81273597）；Innovation and Nursery Foundation of Chinese PLA General Hospital（15KMM28）；and Military Health Care Foundation（13BJ247）

2016-04-12接受日期：2016-06-22）

（本文编辑：贺云霞）

国家自然科学基金项目（81273597）；解放军总医院科技创新苗圃基金（15KMM28）；全军保健基金（13BJ247）

汪海涛，男，硕士，主要从事血液病的基础与临床研究，E-mail：ws_ht@126.com；朱宏丽，女，主任医师，主要从事老年血液病的基础与临床研究。

朱宏丽，E-mail：bjzhl202_cn@sina.com，Tel：（010）66876267；吕 明，Tel：（010）66931325，E-mail：lm62033@163.com