阿魏酸对脊髓损伤大鼠微管相关蛋白轻链3、Beclin1、Bcl-2和Bax表达的影响

俞雪锋，蒋 曦，王国康，张佳佳，赵应征，潘建春

（1.浙江医药高等专科学校，浙江宁波 315000；2.浙江大学明州医院，浙江宁波 315000；3.温州医科大学，浙江温州 325035）

·论 著·

阿魏酸对脊髓损伤大鼠微管相关蛋白轻链3、Beclin1、Bcl-2和Bax表达的影响

俞雪锋1，蒋 曦2，3，王国康1，张佳佳1，赵应征3，潘建春3

（1.浙江医药高等专科学校，浙江宁波 315000；2.浙江大学明州医院，浙江宁波 315000；3.温州医科大学，浙江温州 325035）

目的研究阿魏酸（FA）对脊髓损伤（SCI）模型大鼠的改善作用及其对微管相关蛋白轻链3（LC3）、人卷曲螺旋肌球蛋白样BCL-2结合蛋白/自噬基因1（Beclin1）、Bcl-2和Bax表达的影响。方法采用脊髓压迫损伤动物模型，即动脉钳夹闭脊髓2 min造成SCI。实验分为假手术组、模型6 h，1，3，7和14 d组、FA 100 mg·kg-1（术后po，每天2次）给药6 h，1，3，7和14 d组。SCI后，进行BBB评分和斜板功能评分，随后处死大鼠，取脊髓进行HE染色，采用免疫组织染色法检测LC3和Beclin1蛋白，采用Western蛋白印迹法检测LC-3，Beclin1，Bcl-2和Bax蛋白表达。结果与假手术组相比，模型6 h组BBB评分和斜板功能评分明显下降，分别由21分和70°下降为（0.5±0.5）分和（5.8±2.0）°；而FA给药7 d后BBB评分由模型7 d组的3.0±1.7上升为6.2±3.6（P<0.05），斜板功能评分则由（13.3±4.1）°上升为（26.7±8.7）°（P<0.01）；HE染色发现，SCI损伤后出现组织水肿，结构呈空洞状；FA给药7 ～14 d，脊髓内部水肿及结构空洞得到改善。West⁃ern蛋白印迹法检测结果显示，SCI损伤后1 d，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1表达增加（P<0.01），14 d组蛋白表达相比于1 d组下降（P<0.05）；相对于自噬蛋白，抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，并且Bcl-2与致凋亡蛋白Bax的比值增加（P<0.05）。SCI损伤后给予FA，相比于SCI模型组，1 d组LC3和Beclin1表达增加（P<0.05）；14 d组Bcl-2表达明显增加，其与Bax比值增加更为显著（P<0.05）。结论SCI后可能存在着自噬先增强后减弱的发展过程，而抗凋亡作用可能存在着逐渐增强的趋势。FA对SCI具有潜在的治疗作用，其机制可能涉及对自噬和凋亡的影响。

阿魏酸；脊髓损伤；细胞凋亡；自噬

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种可逆性差、致残率高的中枢神经系统创伤性疾病，发生率逐年增高且呈年轻化趋势，且其治疗也一直是医学界的重点和难点。SCI按病理、生理学机制可分为原发性和继发性损伤。因原发性损伤的不可逆性，目前研究的焦点主要集中于继发性SCI。继发性SCI主要表现为神经受损。自噬和凋亡作为细胞程序性死亡的2种重要方式［1］，是目前SCI后细胞死亡机制的研究热点。

目前，治疗SCI的特效药物几乎不存在，围绕自噬与凋亡机制展开的药物研究成为焦点。雷帕霉素属于自噬增强剂，能改善SCI症状，但其本身具有很强的毒性作用。大多抗凋亡药物起效慢，并且对SCI症状的改善作用较弱。阿魏酸钠（ferulic acid，FA）为多酚类化合物，是中药当归的有效单体成分，具有抗氧化、清除自由基及抗炎等药理作用［2-4］。重要的是，在多种疾病模型的研究中发现，FA具有较强的抗凋亡作用［5-7］；更重要的是，最新研究发现，FA具有增强自噬的作用，且其药物作用强度与雷帕霉素（rapamycin）相当［8］。结合FA抗炎抗氧化的活性，推测其对SCI具有治疗作用。

本研究通过建立SCI大鼠模型，首先确认FA是否能够改善SCI，其次深入研究自噬与凋亡相关蛋白的表达改变，进一步探讨FA治疗作用是否涉及其对自噬和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1药物、试剂和仪器

FA购于美国Sigma公司。微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）抗体（货号：ab128025，100 μL）、人卷曲螺旋肌球蛋白样BCL-2结合蛋白/自噬基因1（human coiledcoil myosin-like BCL2-interacting protein 1，Beclin1）抗体（货号：ab55878，50 μL）、β肌动蛋白（货号：ab1801）和ECL曝光液（货号：120711-92）均购于美国Abcam公司；Bcl-2抗体（货号：sc7382）、Bax抗体（货号：sc6236）和辣根过氧化物酶标记驴抗兔IgG二抗（货号：sc2313）均购于美国Santa Cruz公司；PVDF膜（货号：IPVH00011）购于北京Solarbio公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0012）购于上海碧云天生物技术有限公司。

Avanti-20XP型离心机（美国 Beckman-Coulter）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司；I×70型倒置显微镜（日本Olympus公司）；WDT-Ⅴ型脑立体定向仪（西安西北光电医疗器械厂）；Bio-Rad电泳与转膜设备自动酶标分析仪（美国Bio-Rad公司）；GL-20C高速冷冻离心机（美国Thermo Scientific）；BMJ-Ⅲ型病理组织包埋机（常州中威电子仪器有限公司）；旋转型石蜡切片机（英国珊顿公司）。

1.2动物和大鼠SCI模型的建立

SD雄性大鼠，90只，体质量200 ～220 g，由中国科学院上海动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK（浙）2010-0150。每笼6只，室温23 ～25℃，湿度40% ～60%，昼夜节律，自由摄食饮水。

将无瘫痪、无行动不便的清洁级SD大鼠，ip给予戊巴比妥钠30 mg·kg-1麻醉，大鼠取俯卧位。按肋骨确定椎体序列，以肋骨为标志，取后正中，分离皮肤下筋膜与椎旁肌，暴露位于第8到第9胸椎（T8 ～T9）和T9 ～T10，在T9节段进行椎板切除术打开椎管，完全暴露脊髓背侧面。采用血管动脉夹（30 g）夹闭脊髓2 min，过程中可观察到大鼠后肢和尾部出现痉挛性抽搐后瘫软，之后将动脉夹取下，止血后，去除组织和血块后缝合肌层与皮肤，加热垫维持动物体温在36 ～37℃，直至大鼠完全苏醒。

大鼠苏醒后，常规ip给予青霉素钠20 kU·kg-1，并采用下腹部挤压膀胱人工排尿，每日3 ～4次，直至自主排尿功能完全恢复。

1.3动物分组和处理

大鼠随机分为假手术组、各时间点SCI模型组和FA治疗组（FA给药剂量参照文献报道［9-10］），每组30只。模型组与FA治疗组按照1.2制备模型；假手术组麻醉，但打开椎管后不进行脊髓夹闭。待大鼠苏醒后，FA治疗组po给予FA 100 mg·kg-1，每天2次（10：00与17：00），FA用羧甲纤维素钠（carmellose sodium，CMC-Na）溶解，且新鲜配制，其他各组则给予CMC-Na。各组大鼠分别于手术后6 h，1，3，7和14 d进行行为学评价，各个时间点测试后每组处死6只大鼠，取T8 ～T10进行染色与生化指标测定。

1.4BBB（Basso，Beattie and Bresnahan）评分和斜板功能评分测试运动能力

1.4.1BBB评分

在造模前以及造模后6 h，1，3，7和14 d的SD大鼠进行BBB运动能力评分。即将大鼠置于一空旷场地，2个观察者对侧站立观察大鼠的臀、膝、踝关节，行走，躯干运动及其协调情况。观察时间为5 min，期间观察者依照评分标准（0 ～21分）进行评分并绘制得分图。由于啮齿类动物自然恢复反射，即便是SCI大鼠也可在损伤后几周内重新获得行走能力，后肢因形成脊髓反射弧可产出运动而无需经过大脑。由于此原因，SCI大鼠在损伤后几周内后肢的活动能力会逐步提高，达到某个平台，但无法恢复正常水平而造成永久性损伤。脊髓夹闭损伤以后，大鼠两后肢的的运动能力丧失，肌力降为零。BBB评分<5，说明造模成功。实验中采用双盲、双人独立观察记录，最后取均值。

1.4.2斜板功能评分

将大鼠头朝左横放在改良的Rivlin斜板上，从水平位置（0°角）起逐渐增大角度，以大鼠能够在板上停留5 s而不跌落的最大角度作为评分标准，试验中采用双盲、双人独立观察记录，重复3次取其平均值。

1.5HE染色观察脊髓损伤程度

在每组相对应时间点，取大鼠用戊巴比妥钠30 mg·kg-1麻醉。将大鼠由腹部至胸骨剪开，暴露心脏，由左心室插入注射针头，同时剪开右心耳，待右心耳流出液体变澄清后，更换为4%多聚甲醛快速灌注，待大鼠肢体僵硬后，解剖椎管取出损伤段脊髓，小心取出损伤处上下各0.5 cm脊髓，置于4%多聚甲醛中固定24 h。脊髓固定后，用纱布包好放在细水流下冲洗过夜。乙醇梯度脱水后包埋切片，厚度为4 μm。HE染色过程：在63 ～65℃温度下烘片3 ～4 h后，进行脱蜡水化，染色后采用5%乙醇脱水，二甲苯透明，封片后，在显微镜下观察脊髓损伤程度。

1.6免疫组化检测LC3和Beclin1表达

免疫组化染色操作均按照免疫组化试剂盒说明书进行。取已固定的脊髓组织，包埋切片，厚度为4 μm，切片后进行脱蜡脱水，经过PBS溶液洗涤后，经热修复抗原，进行封闭过程，封闭结束后，依次进行一抗孵育2 h与二抗孵育1 h，随后进行DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封片。封片后，在显微镜下观察免疫组化染色结果。

1.7 Western蛋白印迹法检测LC3，Beclin1，Bcl-2和Bax蛋白表达

各组样本加300 μL的细胞裂解液（含蛋白酶和磷酸化酶抑制剂），匀浆后离心2次取上清液，BCA法进行蛋白定量。上样量为60 μg蛋白，电泳分离及转膜后，室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h或4℃封闭过夜，4℃孵育一抗过夜（LC3和Beclin1稀释比为：1∶1000 ～1∶2000），之后TBST洗膜3次，每次8 min，结束后加入二抗（稀释倍数：1∶10 000）反应1 h，洗膜3次，每次8 min。曝光显影后，以β肌动蛋白作为内参照，以目标蛋白与内参蛋白的积分吸光度的比值表示蛋白的相对表达水平。

1.8统计学分析

采用SPSS16.0统计软件包进行统计学处理，数据以x±s表示，数据进行多因素方差分析。组间的多重比较用Duncan检验。单因素方差分析中，采用Dunnettt检验进行多重比较。

2 结果

2.1FA对SCI大鼠BBB运动能力评分和斜板功能评分的影响

脊髓夹闭手术后，各组大鼠并未出现死亡情况，均存活。各组大鼠在SCI前及损伤后6 h，1，3，7和14 d分别进行了BBB运动能力评分和斜板功能（图1）。假手术组脊神经功能正常，BBB为21分，具有良好的运动功能。在SCI后，各组的BBB均稳定在0 ～1分间，说明SCI大鼠模型成功制备，且损伤较为一致，减少了实验误差。经历7 d给药后，治疗7 d组评分6.2±3.6，明显高于SCI模型组的3.0±1.7（P<0.05），并且随着给药天数的增加，评分差异更为显著（P<0.01）。

斜板评分实验的结果与BBB结果相似（图1B）。给药7 d后，FA治疗组所测得的斜板角度为（26.7±8.7）°，与SCI组的（13.3±4.1）°相比明显增加（P<0.01）；随着给药天数的增多，斜板角度也随着增大，与SCI组相比具有显著差异（P<0.01）。

Fig.1 Effect of ferulic acid（FA）on Basso，Beattie andBresnahan（BBB） locomotiontest（A） and inclined plane test（B）of spinal cord injury（SCI）rats.A spinal cord compression injury model was chosen to establish an SCI rat model in this experiment.During surgery，moderate contusion injuries were induced in rats using a vascular clip for 2 min，while sham group received the samesurgical procedures，but impaction had no effect on the spinal cord by the vascular clip.After SCI surgery，rats received two administrations（10：00 am and 5：00 pm）of FA（100 mg·kg-1，po）or vehicle（CMC-Na）for 14 d.BBB scoring method and inclined plane test were used to assess rat motor function at 6 h and 1，3，7 and 14 d.x±s，n=6.*P<0.05，**P<0.01，compared with SCI model group.

2.2FA对SCI大鼠脊髓组织的影响

HE染色显示，正常大鼠T8 ～T10段脊髓组织结构正常，纤维走向平行一致，且具有一定的连续性，且无出血现象和瘢痕组织生成。检测造模后随时间推移（6 h，1，3，7和14 d）大鼠受损脊髓的病理情况发现，在损伤出现的初期，脊髓内部出血，结构紊乱，逐渐出现组织水肿，瘢痕形成，出现组织纤维错乱，神经元减少，脊髓受损逐渐加重，最终脊髓结构呈明显空洞状。在给予FA 7 d后，脊髓灰质神经元略有增加，白质中的神经纤维排列具有一定的方向性，但排列依旧紊乱；给药14 d后，脊髓灰质白质界线较为清晰，空洞状有明显改善（见图2）。

Fig.2 Effect of FA on pathology of SCI rats by HE staining（10×）.See Fig.1 for the treatment.

2.3FA对SCI大鼠脊髓中Beclin1和LC3表达的影响

2.3.1免疫组织化学

图3和图4免疫组化结果表明，损伤前脊髓内Beclin1和LC3阳性细胞数目较少，即图中的棕色部分较少，而在损伤后6 h和1 d，Beclin1和LC3的阳性细胞均有增加，表现为图中的棕色部分增加；在损伤后7 ～14 d，尤其是14 d组，Beclin1（图3F）与LC3（图4F）的阳性细胞数较损伤后6 h和1 d组，棕色阳性细胞数降低。相比于模型组，FA给药6 h，1，3，7和14 d组也呈现出相似的变化趋势。其中，FA给药1 d组，Beclin1和LC3的棕色阳性细胞较损伤前明显增加。

Fig.3 Effect of FA on expression of LC3 in spinal cord of SCI rats by immunohistochemical staining. See Fig.1 for the treatment.Scale bar=150 mm.Arrows show postive LC3 protein.

Fig.4 Effect of FA on expression of Beclin1 in spinal cord of SCI rats by immunohistochemical staining. See Fig.1 for the treatment.Scale bar=150 mm.Arrows show postive Beclin1 protein.

2.3.2Western蛋白印迹法

如图5所示，与假手术组相比，模型组各时间点LC-Ⅱ/LC-Ⅰ（6 h除外）和Beclin表达明显上调（P< 0.05，P<0.01）。与模型1 d组相比，FA 1 d治疗组LC-Ⅱ/LC-Ⅰ及Beclin表达显著上调（P<0.05），其他时间点FA治疗组两蛋白表达相对模型组有下调趋势，但无统计学差异。

Fig.5 Effect of FA on expression of LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ（A）and Beclin1（B）in spinal cord of SCI rats by Western blotting.See Fig.1 for the treatment.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1.x±s，n=6.*P< 0.05，**P<0.01，compared with sham（0 h）group；#P<0.05，compared with SCI model group.

2.4FA对SCI大鼠脊髓中Bcl-2和Bax表达的影响

如图6所示，SCI后6 h ～7 d，Bcl-2与Bax的比值与假手术组相比无明显变化；而14 d组，Bcl-2表达增加，比值也明显增加（P<0.05）。相比于模型组，FA治疗组Bcl-2与Bax的比值损伤后6 h ～3 d组无明显变化，但7 ～14 d组比值显著增加（P< 0.05）。

Fig.6 Effect of FA on expression of Bcl-2 and Bax in spinal cord of SCI rats by Western blotting.See Fig.1 for the treatment.B was the semi-quantitative results of A.x±s，n=6.*P<0.05，**P<0.01，compared with sham（0 h）group；#P< 0.05，compared with SCI model group.

3 讨论

SCI的病理变化机制复杂，但其共同的主要表现为损伤后大量脊髓神经的坏死。自噬与凋亡作为神经死亡的主要进程，越来越多的研究表明自噬与凋亡机制与SCI密切相关。研究发现，在SCI早期给予西罗莫司（自噬增强剂）增强自噬后，能明显改善大鼠的运动能力，表明增强自噬能明显改善SCI病症，同时抗凋亡作用的增强也是SCI修复的关键因素［11］。FA是中药当归的主要有效成分之一，研究表明，其具抗凋亡作用的同时，具有西罗莫司相当的调控自噬的作用，结合SCI的病理特点与FA的药理作用特点，推测FA能够改善SCI病症。这一推测也在本研究中得到了证实。本研究行为学结果表明，在SCI后，FA连续给予7 d能明显改善脊髓损伤后的运动能力障碍，表明FA对SCI后的运动功能障碍有明显的治疗作用。HE染色结果发现，FA能够改善SCI后的脊髓内部出血、组织水肿及脊髓结构空洞化，这一结果也验证了行为学实验，表明FA通过改善脊髓内部微环境从而发挥治疗作用。

为进一步研究FA治疗SCI的分子机制，本研究检测了自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达。Beclin1是自噬重要的正调节因子，其主要通过控制自噬体的形成，从而调节自噬活性，在自噬起始阶段起重要作用［12-13］。本研究结果显示，Beclin1在SCI损伤初期，即SCI损伤后6 h ～1 d蛋白表达明显增加，表明SCI损伤初期出现自噬，同时Beclin1的表达增加也验证了其对自噬起始阶段的影响，在其他缺氧缺血诱导的神经疾病动物模型中也发现，Beclin1的表达呈现损伤后初期增强的特点［14］。Kanno等［15］发现，SCI损伤后Beclin1的表达在损伤后4 h开始增加，在24 h达到峰值，这一结果也与本研究结果相符。在给予FA后，Beclin1表达明显增加，表明FA在SCI初期增强了自噬。FA的增强自噬作用与其拟雷帕霉素样的药理作用密切相关，雷帕霉素能抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的活性而使得自噬被激活［16］，mTOR是自噬的主要调控蛋白。FA已被证明是一类天然的mTOR抑制剂［8］，因此FA能明显增加SCI初期的Beclin1蛋白表达，与其抑制mTOR活性相关。本研究结果表明，在SCI损伤后期，Beclin1表达从损伤后3 d开始下降，这一结果也与而Kanno等［15］研究相符。而给予FA后，Beclin1蛋白表达并没有升高，反而呈现下降趋势，与其自噬增强作用不符，这可能与FA的抗凋亡作用有关。Beclin1与细胞凋亡因子——Bcl-2存在自噬/凋亡互反馈作用，大量研究也证实，Bcl-2对自噬起着抑制作用［17-18］，尤其是对Beclin1蛋白表达的抑制作用，而FA在各类细胞亦或是动物模型中，都表现出强大的抗凋亡作用，同时表现出增加Bcl-2的表达［4-7］。这表明在SCI损伤后期，FA可能通过增加Bcl-2的表达，增强抗凋亡作用，一定程度上抑制了自噬蛋白Beclin1的表达。

LC3也是自噬检测过程中常用的一种蛋白。LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式，分别定位于前自噬体和自噬体膜表面。当自噬发生时，LC3-Ⅰ将向LC3-Ⅱ转变，这一转变过程代表着自噬的发生过程。本研究结果显示，假手术组LC3-Ⅱ表达较少，而SCI损伤后初期表达明显增加，且在损伤后1 d达到峰值，这一结果与Kanno等［19］、Carloni等［20］和Ginet等［21］的报道结果相吻合，LC3-Ⅱ表达达到峰值大多在SCI损伤后12 h ～3 d，之所以有这样的时间差距，可能是因为各自采用的动物模型不同或是脊髓夹闭时间的不同而造成损伤程度不一，从而导致LC3-Ⅱ达峰时间的不同。在LC3-Ⅱ变化的同时，LC3-Ⅰ的变化并不明显，这也符合相关研究的报道，因为在Western蛋白印迹实验中，LC3-Ⅱ较LC3-Ⅰ更为敏感［22］，因此LC3-Ⅱ表达的变化更易被检测。在给予FA后，发现初期的LC3-Ⅱ表达明显增加，表明FA在SCI初期增强了自噬，这是依赖于对mTOR的抑制作用，而在SCI后期，FA的增强自噬作用消失则可能与机体自身抗凋亡机制的产生密切相关。

基于本研究LC-3和Beclin1蛋白表达的变化，推测SCI后期FA可能存在抗凋亡作用。为了论证这一假说，本研究检测了凋亡相关蛋白的表达。凋亡是一种受到多层次、多通路、多基因蛋白调控的途径，多种基因参与凋亡的调控，这些基因主要包括Bcl-2家族基因，即刻早期基因，p53和Ice基因家族等。其中，最为主要的有Bcl-2和bd-XL等抑制调亡的基因，以及Bax和BIK等促进调亡的基因［23-24］。因此，本研究检测了抗凋亡蛋白Bcl-2与致凋亡蛋白Bax的表达，并且两者作为细胞凋亡的最后通路之一，也与SCI密切相关［25-26］。研究结果发现，在SCI损伤早期，Bcl-2的表达并无明显的增加，同时Bax的表达也未见下降，两者比值与假手术组相比无明显变化，而在SCI后14 d，Bcl-2表达增加，Bax表达减少，随着时间的推移，比值明显变大，表明抗凋亡作用增强，FA能明显增加SCI后期的Bcl-2与Bax的比值，表明在SCI后期，FA通过增强抗凋亡作用，改善SCI病症，同时因为自噬与凋亡的互反馈调节作用，FA后期的抗凋亡作用可能抑制其自噬增强的作用，这在一定程度上解释了SCI后期FA增强自噬作用消失的现象。

基于本研究结果，课题组提出以下推测：①在SCI损伤后初期，大量神经受损，自噬机制启动，因此初期的自噬最为明显，FA通过增强自噬能够增强清除作用，有利于脊髓损伤的治疗；②SCI后期模型组自噬现象的减少，可能是由于机体自身抗凋亡机制的启动，而FA干预后，因其本身强大的抗凋亡特点，尤其是对Bcl-2表达的上调，从而一定程度上抑制自身自噬增强的作用，从而导致FA给药在后期对自噬并无明显增强作用。

综上所述，FA治疗作用可能涉及对自噬和凋亡的影响，同时揭示了SCI后自噬可能存在着先增强后减弱的发展过程，而抗凋亡作用则可能存在一个逐渐增强的过程，药物通过增强前期的自噬或是增强后期抗凋亡作用可能均会发挥良好的治疗作用。进一步研究自噬与凋亡机制的相互作用对SCI病程发展的影响，为SCI的发病机制提供新的理论依据，为相关治疗药物的研发开拓新方向。

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Effect of ferulic acid on expression of microtubule-associated protein light chain 3，Beclin1，Bcl-2 and Bax in spinal cord injury rats

YU Xue-feng1，JIANG Xi2，3，WANG Guo-kang1，ZHANG Jia-jia1，ZHAO Ying-zheng3，PAN Jian-chun3
（1.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315000，China；2.Mingzhou Hospital Zhejiang University，Ningbo 315000，China；3.Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of ferulic acid（FA）on motor function of rats with a spinal cord injury model（SCI）and its possible effects on expression of microtubule-associated protein light chain 3（LC3），Beclin1，Bcl-2 and Bax.METHODS SD rats were randomly divided into 3 groups：sham group，SCI group，FA（100 mg·kg-1，po）group.Rats were subjected to moderate contusion inju⁃ries using a vascular clip for 2 min to establish an SCI animal model beforfe they were given BBB scores and inclined plate scoring function test on 6 h，1，3，7 and 14 d after SCI.After the test，rats were sacrificed.Spinal cords were observed by hematoxylin eosin（HE）staining.Furthermore，the expressions of LC3，Beclin1，Bcl-2 and Bax were detected by Western blotting.RESULTS Compared with the sham group，BBB scores and inclined plate function scores significantly decreased in model group.The BBB scores decreased from 21 in sham group to（0.5±0.5）in SCI group，and inclined plate function scores decreased from 70°in sham group to（5.8±2.0）°in SCI group.However，this was reversed by FA treatment. BBB scores and inclined plate function scores increased from 3.0±1.7 to 6.2±3.6（P<0.05）and from（13.3±4.1）°to（26.7±8.7）°（P<0.05）after FA waspogiven for 7 d，respectively.HE staining showed the gradual emergence of internal spinal cord edema，while the structural changes associated with spinal cord injury could be significantly reversed by administration of FA.Moreover，the expression of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand Beclin1 was significantly increased in SCI 1 d group（P<0.01），but was decreased in 14 d group when compared with SCI 1 d group（P<0.05）.The expression of Bcl-2 was increased in SCI 14 d group，and the ratio of Bcl-2/Bax was increased on 14 d after SCI（P<0.05）.Compared with the SCI group，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand Beclin1 expression was increased in FA-treated 1 d group（P<0.05），Bcl-2 expression was increased in FA-treated 14 d group and the ratio of Bcl-2/Bax was significantly increased on 14 d after SCI（P<0.05）.CONCLUSION FA has a therapeutic effect on SCI，which may be related to the impact of neuronal autophagy and apoptosis.Meanwhile，autophagy of SCI may be a process of gradual enhancement followed by weakening，and the anti-apoptosis effect may gradually increase with autophagy.

ferulic acid；spinal cord injury；apoptosis；autophagy

YU Xue-feng，Tel：15088556139，E-mail：349401267@qq.com

R963

A

1000-3002-（2016）07-0714-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.002

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81360195）

2015-10-30接受日期：2016-04-11）

（本文编辑：乔 虹）

国家自然科学基金项目（81360195）

俞雪锋，男，硕士研究生，助教，主要从事神经精神药理学研究。

俞雪锋，E-mail:349401267@qq.com