不同方法比较黄酮类化合物抗氧化性及其构效关系分析

刘庆庆,张薇娜,刘 琴

(南京财经大学食品科学与工程学院;江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室;江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心,江苏南京 210023)



不同方法比较黄酮类化合物抗氧化性及其构效关系分析

刘庆庆,张薇娜,刘 琴*

(南京财经大学食品科学与工程学院;江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室;江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心,江苏南京 210023)

通过三种化学抗氧化方法(DPPH、FRAP和ORAC法)以及细胞抗氧化方法(CAA法)对芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素4种黄酮甙元及它们的糖苷化合物抗氧化活性进行比较研究,结果表明DPPH和FRAP法基本一致,芹菜素、牡荆素和异牡荆素这类C环上无羟基且B环只有一个羟基的黄酮抗氧化性极低;在C环上的羟基相同时,B环有3′,4′-邻二羟基的木犀草素和槲皮素的抗氧化活性显著高于仅含4′-OH的芹菜素和山奈酚;而ORAC法的结果与此相反。化学抗氧化测定结果均表明,当C环羟基被取代形成3-O-连黄酮苷时其抗氧化活性减小;而A环上6、8号位的氢被取代形成C-连黄酮苷时其抗氧化性反而会增加。CAA法结果显示,当C环无羟基时,B环只有一个4-OH的芹菜素及其黄酮苷无细胞抗氧化性,但B环有两个羟基的木犀草素及其糖苷却显示出较强的氧化性。与化学抗氧化性不同,A环上C-连黄酮苷的抗氧化性低于其苷元,而C环O-连糖苷的影响则较为复杂。

黄酮,化学抗氧化性,细胞抗氧化性,构效关系

正常的代谢过程中会产生多种形式的自由基,这些自由基与细胞信号传导等多种生理功能有关[1-2],但过剩的自由基会增加糖尿病、癌症等疾病的患病风险[3-4]。黄酮类化合物是植物重要的次生代谢产物,其基本骨架结构为两个芳环(A环与B环)通过一个三碳链(C环)连接而成[5-6]。黄酮类化合物具有较强的抗氧化能力,能有效清除自由基,因此被认为具有抗衰老、降低慢性非传染性疾病的患病风险的功能[7-8]。黄酮化合物的种类繁多,其结构与抗氧化活性的构效关系是黄酮研究关注的焦点之一[9-10]。在这些研究中,不管是采用计算[11]还是实验方法,主要关注的是B环上3′,4′-位和C环上3-位羟基的影响以及C环C2=C3双键的影响[12-15],而对于糖苷取代的影响,尤其是C-苷取代对抗氧化性影响的研究还很少。此外,大多数抗氧化性的构效关系研究采用单一的评价方法,而不同的抗氧化评价方法机理不同,因此所得到的抗氧化性结果之间有一定的差异,如Zhang等[16]的研究表明牡荆素在DPPH法中显示出远低于槲皮素和芦丁的抗氧化性,而在ABTS法中却与芦丁相当。因此要全面了解黄酮类化合物抗氧化的构效关系需要通过多种方法进行综合评价。

本文根据B环和C环上羟基的不同及糖苷的联接方式不同,选取了芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素4种黄酮甙元及它们的糖苷化合物,通过三种化学抗氧化方法(DPPH、FRAP、ORAC法)和细胞抗氧化方法(CAA法)进行抗氧化性评价,并对它们的抗氧化构效关系进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芹菜素、牡荆素、异牡荆素、山奈酚、木犀草素、荭草素、异荭草素、金丝桃苷、芦丁,纯度≥98% 均购自阿拉丁试剂公司;人肝癌细胞株 HepG2 购自中国科学院肿瘤细胞库。

Trolox(水溶性维生素E)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH自由基)、2,2′-偶氮二异基脒二盐酸盐(AAPH)、2,4,6-三(2′-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)、荧光素钠(Fluorescein disodium)、2′,7′-二氯荧光二乙酸(DCFH-DA)、细胞培养级二甲基亚砜(DMSO) 购自Sigma-Aldrich公司。

DMEM高糖培养基、0.25%(w/v)胰酶-EDTA消化液、胎牛血清(FBS)、双抗(penicillin-striptomyin,liquid),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,噻唑蓝) 购自 HYCLONE公司。

甲醇、盐酸、三氯化铁、无水乙酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠 均为分析纯 购自南京化学试剂厂。

SpectraMax M2e多功能酶标仪 美国分子仪器公司(MD);UV-2401PC紫外可见分光光度计 日本岛津公司;Milli-Q Academic超纯水系统 美国 Millipore公司;Allegra 64R高速冷冻离心机 美国贝克曼公司;HERA-cell150 CO2培养箱 美国 Thermo公司;XD30 型倒置显微镜 舜宇公司;SX-500快速自动高压灭菌锅 日本TOMY Digital Biology公司;JA5003N电子天平 上海精密科学仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DPPH法 所有的黄酮化合物用甲醇配成浓度为0.4 mmol/L的溶液,根据Liu等[17]的方法进行DPPH自由基清除率ΔA%的测定,同时以Trolox为标品绘制标准曲线。计算结果(DPPH)以Trolox 当量表示(mmol/mmol),即每毫摩尔样品对 DPPH清除能力相当于Trolox 的毫摩尔数。

1.2.2 FRAP法 按照文献[18]报道配制 TPTZ工作液。用甲醇配制浓度为0.5 mmol/L的样品溶液,取0.1 mL样品与 TPTZ 工作液0.9 mL及醋酸钠缓冲溶液9.0 mL混合,避光封口于37 ℃水浴反应30 min后测定596 nm处的吸光度值,同时以Trolox为标品绘制标准曲线。计算结果(FRAP值)以Trolox 当量表示(mmol/mmol),即每毫摩尔样品对Fe3+-TPTZ还原能力相当于Trolox 的毫摩尔数。

1.2.3 ORAC法 根据参考文献中的方法[19],用pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.2 mol/L)配制浓度均为1.0 μmol/L的样品溶液,取100 μL样品与50 μL荧光素钠(0.4 μmol/L)在96孔板中混合,37 ℃下孵化15 min后快速加入50 μL AAPH溶液(66.66 mmol/L)。在激发波长485 nm、发射波长538 nm下每隔1 min测定一次,100 min后记录各样品的荧光衰减曲线下面积(AUC值),同时以Torlox为标品绘制标准曲线。计算结果(ORAC值)用Trolox当量表示(mmol/mmol),即每毫摩尔样品对氧自由基吸收能力相当于Trolox的毫摩尔数。

1.2.4 细胞抗氧化性(CAA)法

1.2.4.1 细胞培养 本实验根据参考文献[20],将人体肝癌细胞HepG2接种于25 cm2细胞培养瓶,用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM作为培养液,在37 ℃、5% CO2条件下进行培养。根据细胞生长情况进行换液或者传代,成长至对数期的细胞即可用于实验。

1.2.4.2 MTT实验 取生长趋势较好的HepG2细胞,消化后用培养液配制成浓度为2×104个/mL的细胞液,取100 μL细胞悬液加入无菌96孔板,于CO2培养箱中培养24 h后,再加入100 μL不同浓度(5、10、20、40、80、100、200、400 μmol/L)的样品溶液(空白用DMEM代替),再培养24 h后加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液,继续培养4 h后吸弃孔中液体,再加入200 μL DMSO,于避光37 ℃下充分震荡30 min,测定570 nm处的OD值。计算不同样品浓度下HepG2细胞存活率(细胞存活率(%)=(样品的OD值/空白的OD值)×100 。

1.2.4.3 CAA实验 取生长趋势较好的HepG2细胞,消化后用培养液配制成浓度为6×104个/mL的细胞液,取100 μL加入96孔板,于CO2培养箱中培养24 h后移去上清液,并用100 μL PBS清洗后加入25 μmol/L的DCFH-DA溶液与不同浓度的样品溶液(5、10、20、40、80 μmol/L)各50 μL(空白用DMEM代替),继续培养1 h后吸弃孔中液体,并立即加入100 μL 25 μmol/L的ABAP,在37 ℃下孵化,测定激发波长为485 nm,发射波长538 nm的荧光值,每5 min测一次,共跟踪测定60 min。

图1 十种黄酮类物质的结构Fig.1 Molecular structures of flavonoids

按照如下公式计算不同黄酮类化合物的细胞抗氧化活性(CAA)值:

用fa表示CAA值,fu表示(1-CAA)值,通过lg(fa/fu)与对应样品浓度的对数值lgC作图,当lg(fa/fu)=0时对应的浓度为样品清除氧化自由基的半数有效浓度即EC50值。

1.3 数据分析

每组实验均进行三组平行实验,实验数据以平均值±SD表示,所有显著性分析均基于p<0.05的显著水平。

2 结果及分析

2.1 不同结构黄酮化合物的化学抗氧化活性比较

图1是本研究中所涉及的黄酮化合物结构示意图。

三种化学抗氧化方法(即DPPH、FRAP和ORAC法)的标准曲线分别如下:A1=145.16B-2.0987,R2=0.9990;A2=0.3317 B+0.0444,R2=0.9993;A3=0.2109 B+0.3516,R2=0.9910。式中A1为DPPH自由基清除率,A2为FRAP法中的吸光度值,A3为ORAC法中的AUC值,B为Trolox的浓度。根据标准曲线,十种黄酮化合物的抗氧化活性测定结果见表1。

表1 十种黄酮类物质的DPpH、FRAP值和ORAC值
Table 1 DPPH、FRAP and ORAC values of ten flavonoids

样品抗氧化能力mmol(Trolox)/mmol(样品)DPPHFRAP值ORAC值芹菜素0019±00008g0137±0005f2569±0145ef牡荆素0050±00011f0172±0004e3707±0269a异牡荆素0057±00014f0181±0002e3754±0152a山奈酚0743±0023e1823±0045d3427±0201bc木犀草素1865±0017d1951±0021c1984±0142g荭草素1887±00049c2790±0036b2529±0033f异荭草素1900±0012c2756±0042b2576±0100ef槲皮素2199±0017a3790±0021a3406±0142b金丝桃苷2100±0017b2702±004b2943±0152cd芦丁2061±0023c2672±0021b2853±0072d

注:肩标字母不同表示差异显著,p<0.05。

由表1可以看出,DPPH和FRAP法的测定结果基本一致,即槲皮素、金丝桃苷和芦丁均显示出较强的抗氧化能力;其次是木犀草素、荭草素、异荭草素和山萘酚,而牡荆素、异牡荆素和芹菜素均显示较低的抗氧化能力。在两种方法中槲皮素均表现出最强的抗氧化性,而芹菜素则表现出最低的抗氧化性。但是,ORAC法的结果与前两者均存在较大差异,前两者测定中抗氧化性很低的芹菜素、牡荆素、异牡荆素和山奈酚在ORAC法中均表现出较高的抗氧化能力,其中牡荆素和异牡荆素抗氧化能力最高,约为Trolox的3.7倍。三种方法中的抗氧化性结果一致的是B环上均含两个羟基的黄酮醇及其糖苷衍生物槲皮素、金丝桃苷和芦丁的抗氧化性大于同样是B环上有两个羟基的黄酮及其黄酮苷木樨草素、荭草素和异荭草素;牡荆素、异牡荆素的抗氧化性大于芹菜素;荭草素、异荭草素的抗氧化性大于木樨草素;槲皮素的抗氧化性大于金丝桃苷和芦丁。

2.2 黄酮类化合物细胞抗氧化活性的比较

2.2.1 十种黄酮类物质的MTT实验结果 细胞抗氧化性实验(CAA法)作为近年来广泛使用的抗氧化能力测定方法,其以细胞为反应主体,更加接近人体生理条件。在考察CAA前,必须先保证实验中所用浓度范围内的样品不会对细胞产生毒性,以防对结果产生干扰。MTT法测定细胞毒性的结果如图2。

图2 十种黄酮类物质在不同浓度下的细胞存活率Fig.2 Cell survival probability of ten flavonoids

由图2可知,这十种黄酮类物质在浓度0～400 μmol/L范围内时细胞存活率在90%～110%之间,细胞致死率在10%之内,不会对HepG2产生明显毒性,所以样品可在0～400 μmol/L范围内进行CAA实验。

2.2.2 十种黄酮类物质的CAA实验结果 图3为不同浓度的样品对人体肝癌细胞HepG2中荧光强度的变化随时间的动力学曲线。由图3可见山奈酚、木犀草素、荭草素、异荭草素、槲皮素、金丝桃苷和芦丁这7种样品浓度在5～80 μmol/L范围内随着化合物浓度增加,细胞内的荧光值显著降低,说明以上7种黄酮都能有效抑制细胞内氧化自由基的产生,且其抗氧化能力与浓度正相关。同时发现,芹菜素、牡荆素和异牡荆素这3种黄酮即使浓度从5 μmol/L增加到400 μmol/L时其细胞荧光值的变化不明显,这表明芹菜素、牡荆素和异牡荆素几乎不表现出细胞抗氧化性,这与Wolfe等[9]人的研究结果一致。

根据有显著细胞抗氧化活性的7种样品的荧光曲线下积分面积(AUC值),按照1.2.4.3计算CAA 值,再通过对数法作lg(fa/fu)与lgC的线性回归方程,当lg(fa/fu)=0时对应的浓度为样品清除氧化自由基的半数有效浓度即EC50值(图4),EC50值越低,表明其细胞抗氧化性越高。

图4 七种黄酮抑制活性氧氧化DCFH的EC50值Fig.4 EC50 Values for inhibition of peroxyl radical-induced DCFH oxidation by seven flavonoids

由图4可见,除去不显示细胞抗氧化性的芹菜素、牡荆素和异牡荆素外,木犀草素具有最高的细胞抗氧化性,山奈酚其次,荭草素和异荭草素这两个木犀草素的C-连糖苷异构体的抗氧化性低于山奈酚。尽管C环上多了一个羟基,但槲皮素的细胞抗氧化性反而低于B环羟基相同而C环无羟基的木犀草素;C环上被单糖取代的金丝桃苷的抗氧化性低于甙元槲皮素,而二糖取代的芦丁反而高于甙元槲皮素。这与化学抗氧化性不同,说明黄酮C环上的羟基可能对细胞抗氧化性的贡献不起主要的作用。

2.3 抗氧化活性的构效关系分析

2.3.1 化学抗氧化性的构效关系分析 研究表明,C环、B环的羟基是影响黄酮类化合物的抗氧化性的主要因素。前线轨道理论和脂质过氧化实验表明,B环羟基是影响黄酮类物质抗氧化性的关键基团:孙庆雷[11]等人通过理论计算,说明黄酮抗氧化性与B环羟基的位置及数量密切相关;刘帅涛[14]等也通过对四种黄酮小分子清除DPPH自由基能力的比较发现B环上的邻二酚羟基比只有一个4-OH结构的抗氧化性强,这与本研究的DPPH和FRAP结果一致,即C环没有羟基且B环只有一个4′-OH的芹菜素、牡荆素和异牡荆素均表现出极低的抗氧化性。B环比山奈酚多一个3′-OH的槲皮素,其DPPH和FRAP值都约为山奈酚的2～3倍。

图3 十种黄酮类物质对HepG2细胞荧光强度-时间动力学曲线的影响Fig.3 Effects of ten flavonoids on fluorescence in HepG2 cells

然而,与DPPH和FRAP法相反,在ORAC法中当A环和C环相同,B环只有一个4′-OH的化合物的抗氧化性反而高于B环上含3′,4′-邻二羟基的黄酮,如芹菜素、牡荆素和异牡荆素的抗氧化性分别高于木犀草素、红草素和异荭草素;山萘酚的抗氧化性高于槲皮素。这与Tabart等[21]的报道相似,在他们的研究中分别采用了TEAC法、DPPH法和ORAC法对不同黄酮类化合物进行抗氧化性比较,结果发现在TEAC法和DPPH法中,槲皮素的抗氧化性高于山奈酚,但是在ORAC法中山奈酚的抗氧化性却高于槲皮素。目前还没有解释这一现象的报道,这一差异可能与抗氧化机理有关:前两种方法中黄酮化合物的抗氧化性是分别基于电子转移的自由基清除和氧化态的还原,而ORAC法是基于氢原子转移的抗氧化剂与荧光探针竞争结合自由基的过程[22]。此外,溶剂体系的不同导致黄酮化合物的结构差异可能是影响其抗氧化能力的原因之一:DPPH法采用的是有机溶剂体系,FRAP法采用的是酸性溶液体系(pH3.0),而ORAC法则是pH7.4的磷酸盐缓冲溶液体系,在前两种方法中黄酮B环上的羟基氢不会发生解离,而在pH7.4的条件下,B环上有邻二羟基的其中有一个氢可能会发生解离,而剩下的一个羟基就会跟邻位的氧负离子形成氢键,导致其氢转移能力下降,从而可能导致抗氧化能力有所下降,当然这一推论的证明需要黄酮上不同酚羟基的解离常数为依据。4种甙元中的槲皮素和山奈酚抗氧化性高于芹菜素和木犀草素,可见在ORAC法中C环3-OH作用高于B环的邻二羟基。

三种化学抗氧化性结果也有共同点,如:槲皮素的抗氧化性高于木犀草素,山奈酚高于芹菜素,可见在A环和B环相同的情况下,C环含羟基的黄酮抗氧化性高于C环无羟基的化合物;再如金丝桃苷和芦丁的抗氧化性低于槲皮素,说明当C环上的羟基被糖取代,形成O-连糖苷后会减弱其抗氧化性。郭春梅[12]等人通过Fenton反应体系产生·OH,比较了黄酮类化合物对·OH的清除能力,结果发现槲皮素对·OH的清除作用比芦丁强,这与本文的结果相似。林亲录[13]等人认为黄酮类成苷后位阻增大是导致抗氧化能力降低的原因;陆曦[23]等人比较了四种黄酮类化合物及五种具有羟基的化合物对超氧自由基的清除能力,也发现槲皮素的抗氧化活性高于芦丁。另外,荭草素和异荭草素的抗氧化性均高于木犀草素,牡荆素和异牡荆素的抗氧化性也高于甙元芹菜素,表明黄酮类化合物A环的C-连糖苷反而增加抗氧化性,这在ORAC法中表现得更为突出,因此A环C-连糖苷可能会对抗氧化性有促进作用,这可能是A环上C-苷取代会增加其邻位及对位羟基的电子云密度,从而导致A环羟基的还原性增加。目前还很少有对这一类黄酮化合物的抗氧化性进行比较的报道。

2.3.2 细胞抗氧化性的构效关系分析 细胞抗氧化性(CAA)是测定抗氧化物质通过细胞膜进入细胞内清除细胞内活性氧的能力。CAA法的结果中芹菜素、牡荆素和异牡荆素几乎没有细胞抗氧化性,说明黄酮C环和B环羟基对其细胞抗氧化性也具有显著的影响,C环无羟基且B环只有一个羟基的物质无细胞抗氧化活性,这与Wolfe[9]和Hofer[24]的报道一致。但本研究中C环有一个羟基且B环有两个羟基的槲皮素,其细胞抗氧化性比B环、C环各有一个羟基的山奈酚以及只B环有两个羟基的木犀草素都低。该结果与Hofer等[24]的报道一致,在他们的研究中采用了细胞抗氧化性和细胞磷脂抗氧化性测定方法比较了包括槲皮素、木犀草素和山奈酚在内的黄酮化合物的抗氧化性,结果表明木犀草素和山奈酚的细胞抗氧化性远高于槲皮素,与本文的结果相同,木犀草素略高于山奈酚。但是Wolfe等[9]的报道却刚好相反,槲皮素表现出最好的抗氧化性,山奈酚紧随其后。此外,在本研究中发现O-连糖苷对细胞抗氧化性的影响比较复杂,如甙元槲皮素强于单糖苷金丝桃苷而低于双糖苷芦丁。在Wolfe等[9]的报道中芦丁没有细胞抗氧化性,而在Tabart等[21]的研究中采用了血红细胞进行细胞抗氧化性实验,结果表明杨梅素芸香苷的细胞抗氧化性大于其对应的甙元杨梅素,这与我们实验的结果槲皮素芸香苷(芦丁)的细胞抗氧化性高于槲皮素的结论相近。在本文的CAA实验中还发现,与化学抗氧化性不同,A环的C-连糖苷荭草素和异荭草素均低于其甙元木犀草素,有关A环C-连糖苷对其细胞抗氧化性的影响还鲜有报道。

3 结论

抗氧化能力是功能食品的标签之一。然而,目前还没有任何一种方法可以准确的评价出食品的抗氧化性,这就需要对抗氧化成分的构效关系进行深入研究。本文采用三种化学抗氧化方法和细胞抗氧化方法,测定了十种黄酮类化合物的抗氧化活性,基于溶剂体系对黄酮结构的影响和各自的反应机理,由不同的化学抗氧化性测定结果得到的构效关系既有共性,又有差异。与化学抗氧化方法相比,基于细胞的抗氧化测定方法更具有实际意义,但细胞抗氧化性强弱与样品浓度、同质膜的融合程度以及细胞透膜特性等密切相关,实验方法也较为复杂。与黄酮类化合物的化学抗氧化性报道相比,基于细胞的研究还很少,不同的研究中结果差异也较大,因此黄酮类化合物细胞抗氧化性的构效关系仍需更深入的探索。

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Comparison studies on antioxidant capacities of flavonoids by different assays and the structure-activity relationship implication

LIU Qing-qing,ZHANG Wei-na,LIU Qin*

(College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China)

The antioxidant activities of four flavonoids(apigenin,kaempferol,luteolin,quercetin)and their glycosides were studied by using three chemical assays(DPPH,FRAP and ORAC assays)and cellular antioxidant activity(CAA)method. Both DPPH and FRAP assays showed that apigenin and its glucosides with only one-OH on B ring but without C-OH showed extremely low antioxidant capacity. Flavonoids with 3′,4′-OH on B-ring showed significant higher antioxidant activity than those had only one 4′-OH when they had same structure of C ring. For example,luteolin and quercetin had higher antioxidant activity than that of apigenin and kaempferol,respectively. In the mean time,ORAC assay gave a contrary result. All three chemical assays showed that the antioxidant activities were decreased when C-3-OH was substituted by glycosyl,which suggested that 3-OH on C-ring also contributed to antioxidant capability of flavonoids. Antioxidant capabilities of flavonoids were increased when A-ring was glycosylated at 6 or 8 position and formed C-glycosides. CAA results showed that apigenin and its glycosides with only one OH on B ring but no C-OH had no cellular antioxidant activity. Luteolin with two-OH on B-ring but no C-3-OH showed higher antioxidant activity. Unlike those chemical methods,C-glycosylation on A ring decreased the CAA of its aglycone. The antioxidant activity effect of O-glycosylation on C-ring was more complicated compared with chemical assays.

flavonoids;chemical antioxidant activity;cellular antioxidant activity;structure-activity relationship

2016-07-04

刘庆庆(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：liuqq0419@163.com。

*通讯作者:刘琴(1968-)，女，博士，教授，研究方向：食品化学，E-mail：liuqin31@sina.com。

江苏省高校自然科学研究重大项目( 11KJA550001) ;江苏高校优势学科建设工程资助项目。

TS201.2

A

1002-0306(2016)23-0109-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.012