乳酸菌Lactobacillus sp. strain 2-3厌氧发酵蜂花粉的工艺优化

王 聪,黄 艳,马诗淳,邓 宇,郭 军,吴正云

(1.四川大学轻纺与食品学院,四川成都 610065;2.农业部沼气科学研究所,四川成都 610041;3.农业部可再生能源开发与利用重点实验室,四川成都 610041;4.昆明理工大学生命科学与技术学院,云南昆明 650504)



乳酸菌Lactobacillussp. strain 2-3厌氧发酵蜂花粉的工艺优化

王 聪1,2,3,黄 艳2,3,马诗淳2,3,邓 宇2,3,郭 军4,吴正云1,*

(1.四川大学轻纺与食品学院,四川成都 610065;2.农业部沼气科学研究所,四川成都 610041;3.农业部可再生能源开发与利用重点实验室,四川成都 610041;4.昆明理工大学生命科学与技术学院,云南昆明 650504)

为提高蜂花粉的营养价值,将从蜂粮中分离获得的乳酸菌Lactobacillussp. strain 2-3用于蜂花粉厌氧发酵,以活菌数、感官评分作为主要考察指标,在单因素基础上对蜂花粉厌氧发酵工艺进行优化,通过对正交实验的9个实验组的乳酸菌活菌数、感官评分、总黄酮、总酚、DPPH自由基清除率、甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、还原糖等指标进行检测,对实验结果进行显著性分析和相关性分析,选取代表性指标活菌数、感官评分、异丁酸进行正交优化分析,确定乳酸菌厌氧发酵蜂花粉的最优工艺。结果表明,蜂花粉厌氧发酵的最优发酵工艺为:水分添加量50%、发酵温度37 ℃、乳酸菌接种量10%、发酵时间48 h,发酵蜂花粉活菌数可达54.90×108cfu/g,感官评分为13.33,异丁酸含量3.60 mg/g。此外,总黄酮、总酚和DPPH自由基清除率相较于对照组分别提高了94.17%、83.75%、106.45%;挥发酸的种类更加丰富,产生了丁酸和异丁酸,总挥发酸含量也增加到167.80 mg/g;还原糖含量增至48.70%。结果表明蜂粮源乳酸菌可以应用于蜂花粉发酵,提高了蜂花粉营养价值。

厌氧发酵,乳酸菌,抗氧化,挥发酸,还原糖

蜂花粉(Bee Pollen)是蜜蜂采集花粉后,将其和花蜜等混合而成的颗粒状物质[1],通过乳酸菌等在巢脾中发酵最终成为蜂粮[2-3]。蜂花粉富含蛋白、核酸、维生素等多种营养成分[4],同时也含有黄酮、总酚等抗氧化活性成分[5],近代科学研究和临床应用充分肯定了蜂花粉的医疗保健作用,蜂花粉具有抗疲劳、增强记忆力的作用[6],且对心脑血管疾病、糖尿病、哮喘等均有一定的治疗作用[7]。近年来,花粉已成为风靡世界的营养食品,越来越受到人们的重视。

图1 蜂花粉发酵工艺Fig.1 The fermentation technology of bee pollen

目前蜂花粉在食品领域中的应用主要是直接食用或粉碎后压成片剂或胶囊[8],但花粉坚硬的外壁阻止人体对其营养成分的吸收,必须进行特殊的破壁处理才能使营养成分大量释放出来[9]。有报道称,通过微生物破壁法可以使蜂花粉破壁还可以将内容物中的大分子物质降解成小分子物质,变得更容易被人体吸收,具有操作方便、加工流程简单、破壁率高等优点[10]。乳酸菌是食品发酵中的常用菌种,可赋予食品一定的风味,提高发酵制品的营养价值、防止腐败变质、抑制病原菌生长,并赋予特别的香气和滋味[11]。此外,乳酸菌还具有降低胆固醇、调节肠胃功能、改善免疫状况等功能[12]。杨文超等[13]尝试将蜂粮源乳酸菌应用到蜂花粉中,由于其利用的是好氧乳酸菌发酵,在蜂花粉中发酵性能较差,需先加红曲霉预发酵再接种乳酸菌。

本研究所采用的研究对象Lactobacillussp. strain 2-3分离自西方蜜蜂的蜂粮,以2%(v/v)的接种量37 ℃下培养36 h后,菌液可产生高达9107.88 mg/L的乳酸,在食品开发中具有良好的应用潜力。本研究将蜂粮源厌氧乳酸菌用于蜂花粉发酵中,利用单因素实验和正交实验对其发酵蜂花粉的工艺参数进行了优化,以期达到简化蜂花粉发酵工艺、提高蜂花粉营养成分、增加抗氧化活性物质、改善蜂花粉口感的目的。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

乳酸菌:Lactobacillussp. strain 2-3西方蜜蜂蜂粮源乳酸菌;油菜花粉 购买于汪氏蜜蜂园。

MRS培养基(Thermo Fisher Oxoid);刃天青(SIGMA-ALDRICH,≥99.0%);L-半胱氨酸盐酸盐·一水(SIGMA-ALDRICH,≥99.0%)。

80i荧光相差显微镜 Nikon;VARIOSKAN FLASH酶标仪 Thermo;J2-21高速冷冻离心机 Beckman;7890A气相色谱仪 安捷伦科技有限公司;1200高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蜂花粉发酵的工艺流程 流程图工艺如图1所示。

1.2.2 水分、温度、接种量和发酵时间对发酵蜂花粉活菌数和感官品质影响的单因素考察 水分添加量分别取40%、50%、60%、70%、80%(v/v),发酵温度20、30、37、40、50 ℃,乳酸菌接种量5%、10%、15%、20%、25%(v/v),发酵时间0、24、48、72、96 h,厌氧发酵结束后测定活菌数并进行感官评价。

1.2.3 正交实验 根据单因素实验结果,选择水分添加量、乳酸菌接种量、发酵温度、发酵时间做L9(34)四因素三水平正交优化实验,因素水平表见表1。对照组CK的实验条件根据单因素实验结果,水分添加量取60%,温度取37 ℃,发酵时间48 h,不接种乳酸菌。

表1 发酵工艺正交实验因素水平表
Table 1 Factors and levels for orthogonal arry design

水平因素A水分添加量(%)B发酵温度(℃)C乳酸菌接种量(%)D发酵时间(h)15030524260371048370401572

检测各实验组和对照组的活菌数、总黄酮、总酚、DPPH自由基清除率、代谢产物产量(甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、还原糖),并对其进行感官评分。

1.2.4 显著性和相关性分析 采用IBM SPSS 22.0软件对所测14个指标进行显著性和相关性分析,选取代表性指标进行正交优化分析,以得出蜂花粉的最优厌氧发酵方案。

图2 水分添加量、发酵温度、接种量和发酵时间对发酵蜂花粉活菌数和感官品质影响Fig.2 Effects of water,fermentation temperature,seed solution,fermentation time on the living bacterium,sensory value

1.3 测定方法

1.3.1 挥发酸的测定 准确称取0.10 g发酵后蜂花粉于1.5 mL EP管中,添加0.9 mL的ddH20,13000 r/min离心10 min,取上清,加10 μL浓H2SO4,冰浴30 min后再次离心,取上清于样品瓶中,待测。其中乳酸、甲酸、乙酸、丙酸用液相色谱直接测定;而丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸的测定需在加10 μL浓H2SO430 min后再加入30 μL的甲酸,冰浴30 min后离心,取上清于样品瓶中,用气相色谱测定。

1.3.2 乳酸菌的活菌数计数 准确称取1.0 g发酵后的蜂花粉,十倍稀释法制得适宜稀释度的样品稀释液。选择2～3个适宜稀释度,分别吸取1 mL,倾注法接种到MRS厌氧培养基中,37 ℃厌氧培养48 h(每个稀释度做两个平板)。选取菌落总数在30～300 cfu/g之间的平板计数,取平均值[14](整个操作在厌氧条件下进行)。

1.3.3 抗氧化指标的测定 总黄酮的测定采用络合分光光度法,参考陈南迪等[15],样品预处理时不做超声处理;总酚的测定采用Folin-Ciocaileu比色法[16];DPPH自由基清除能力的测定参考孙丽萍等[17]。

表2 发酵蜂花粉感官评分标准
Table 2 The sensory scoring criteria of fermented bee pollen

项目优质(5～4分)较好(4～3分)较差(2～1分)色泽金黄色，无颗粒花粉黄褐色，无颗粒花粉浅褐色、有颗粒花粉气味香气明显香气较弱有其他难以接受的异味滋味酸甜适口，无苦涩味有酸味，略有苦涩味无酸味，有苦涩味

1.3.4 糖的测定 还原糖的测定采用DNS法[18]。

1.3.5 感官评分标准 对发酵完成的蜂花粉进行感官评分[13],由20名专业人员组成评定小组,以发酵蜂花粉的色泽、气味和滋味为主要评价指标,每个指标满分为5分,总分为15分。评分标准见表2。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

水分添加量、发酵温度、乳酸菌接种量和发酵时间对发酵蜂花粉活菌数和感官品质影响的单因素考察结果,见图2A～图2D。

由图2A、2B可以看出,随着水分添加量、发酵温度的增加,发酵蜂花粉的活菌数、感官评分均呈现先增后减的趋势。水分添加量为60%时活菌数、感官评分均达到最大值,分别为6.93×108cfu/g和13.00,添加量大于60%,花粉的营养成分被过度稀释,不利于乳酸菌的生长;发酵温度为37 ℃时活菌数和感官评分达到峰值,分别为15.6×108cfu/g和13.45,当温度达到50 ℃,蜂花粉颜色由金黄色变成褐色,部分营养物质发生质变,活菌数和感官评分均急剧下降,因此适宜发酵温度为37 ℃;由图2C可以看出,发酵蜂花粉的活菌数随接种量的增加而升高,且在5%～10%之间增幅较明显,增至18.70×108cfu/g,大于10%后增加幅度不大,且口感过酸,感官评分反而降低,从经济角度和适口性考虑,选择乳酸菌的接种量为10%较为合适;图2D显示发酵蜂花粉的活菌数、感官评分随着发酵时间的延长呈先增加后平稳的趋势,在24～48 h是乳酸菌的对数生长时期,增幅最明显,分别增至31.60×108cfu/g和13.51,48～96 h之间增幅并不明显,而发酵时间延长会增加经济成本和时间成本,因此最适发酵时间为48 h。

表3 正交实验结果
Table 3 The results of orthogonal array experiment

实验号CK1234活菌数(108cfu/g)0001440±007e5490±008a3250±018c4500±007b感官评分700±011e933±105d1333±026a1067±049b967±087c总黄酮(mg/g)1201±111f1250±109e2332±021a2196±081a2184±151b总酚(mg/g)480±015d778±012b882±027a857±016a863±052aDPPH自由基清除率(%)2372±097e3675±101d4897±032a5062±172a4136±079c乳酸(mg/g)1571±064g3682±022e8347±547a5322±078b2816±071f甲酸(mg/g)653±008f678±004e1241±007a1133±003b1047±058c乙酸(mg/g)1799±143e681±001f2655±066c2397±01d1866±006e丙酸(mg/g)665±063f877±142e3707±167a1342±041c1298±091d异丁酸(mg/g)000159±003d360±077b245±008c406±006a丁酸(mg/g)000113±001d119±004c131±002a118±001c异戊酸(mg/g)118±004f141±006d163±005c237±016a195±009b戊酸(mg/g)045±004f184±001c189±003b180±002c199±005a还原糖(%)1987±102h3135±05g4870±042b4087±161d4516±015c实验号56789活菌数(108cfu/g)5570±026a990±006g1180±003f1960±007d1220±001h感官评分1100±055b1000±079b867±022d600±038e767±027e总黄酮(mg/g)2221±072a1521±070d1622±012d1390±094e1868±040c总酚(mg/g)830±070a721±054c688±056c719±011c692±036cDPPH自由基清除率(%)442±106b3773±089d4002±299c4308±092b3563±141e乳酸(mg/g)5101±061b4814±127c3512±15e4224±247d5104±051b甲酸(mg/g)693±041e1211±005a893±024d1185±061b686±011e乙酸(mg/g)681±008g2435±037d3615±076a3408±017b645±008g丙酸(mg/g)1349±041c3491±035b1499±16c3325±048b1255±054d异丁酸(mg/g)198±003d212±028c23±003c157±006d162±002d丁酸(mg/g)123±001b118±001c116±001c117±002c117±001c异戊酸(mg/g)126±002d238±008a171±015c135±011d125±002e戊酸(mg/g)109±001e181±002c173±003d177±002d109±001e还原糖(%)4388±08c5137±067a3319±089f3258±112f3658±096e

注:同行数据出现的不同小写字母上标表示差异显著(p<0.05)。

2.2 水分添加量、温度、接种量和发酵时间对发酵蜂花粉品质影响的正交实验结果

按表1的正交因素水平设计L9(34)正交实验,测定9个不同实验组的活菌数、总黄酮、总酚、DPPH自由基清除率、甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、还原糖,并对其进行感官评分,结果见表3。

由表3可以看出,所测9个实验组的活菌数、感官评分、总黄酮、总酚、DPPH清除率、甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、还原糖、感官评分与对照组相比均有显著性差异(p<0.05)。其中,实验组2活菌数为54.90×108cfu/g;感官评分最高为13.33;抗氧化指标总黄酮、总酚和DPPH自由基清除率和对照组有极显著性差异(p<0.05),较对照组分别提高了94.17%、83.75%、106.45%;发酵后蜂花粉挥发酸总量达167.80 mg/g,与对照组48.51 mg/g相比有显著的提高,发酵后的蜂花粉出现了对照组中所没有的异丁酸和丁酸,表明经过发酵,蜂花粉中挥发酸的种类更加丰富;实验组还原糖的含量均高于对照组,表明发酵后还原糖含量得到了较显著的增加。综合来看,实验组2差异性最明显。

2.3 各指标相关性分析

采用IBM SPSS 22.0软件,对各指标进行相关性分析,分析结果见表4。

表4 各指标相关性分析
Table 4 Correlation analyses between different indexes

项目感官评分活菌数黄酮总酚DPPH甲酸乳酸乙酸丙酸异丁酸丁酸异戊酸戊酸还原糖感官评分1活菌数0738∗1黄酮0728∗0870∗∗1总酚0733∗0831∗∗0772∗∗1DPPH06230740∗0735∗0888∗∗1甲酸0332030315046506261乳酸0708∗058306240636∗0724∗04851乙酸-0088-0101-0077-004502830706∗00731丙酸026702150128027504330816∗∗062605561异丁酸0660∗0722∗0754∗0843∗∗0719∗05910487021103451丁酸042204920533823∗∗817∗∗04380587007503560671∗1异戊酸041010295041904480681∗018403820297051304151戊酸0391032902720724∗0688∗0706∗0376041804780756∗0758∗0621还原糖0733∗0639∗0696∗0762∗0669∗06090668∗004405660774∗∗0705∗060905841

注:*显著相关(p<0.05);**极显著相关(p<0.01)。

表5 正交优化
Table 5 The results of orthogonal optimization

实验号ABCD活菌数感官评分异丁酸综合指标111110098045400080257212220983100008150956313330493063703530536421230767050110000683522311000068201650666623120000054602210319731320041036402930255832130211000000000061933210050022800200133均值10580039802120352均值20556056105910510均值3015032604820423极差043023503790158

由表4可以看出,发酵蜂花粉活菌数与总黄酮、总酚极显著相关(p<0.01),与感官评分、DPPH自由基清除率、异丁酸、还原糖显著相关(p<0.05);感官评分与黄酮、总酚、乳酸、异丁酸、还原糖显著正相关;异丁酸与总酚、还原糖极显著相关,与黄酮、DPPH自由基清除率、丁酸、戊酸显著相关,因此选取感官评分、活菌数、异丁酸3个代表性指标。

2.4 代表性指标正交优化分析

选取活菌数、感官评分、异丁酸含量3个代表性指标做正交优化分析。通过权重法[19]计算得出活菌数、感觉评分和异丁酸含量的权重值分别为0.29、0.5和0.21,并将三个指标的标准化值变换到0～1,计算综合指标:

综合指标=活菌数标准化值×0.29+感官评分标准化值×0.5+异丁酸含量标准化值×0.21。

由表5,发酵工艺的最优组合为A1B2C2D2,即水分添加量50%,发酵温度37 ℃,乳酸菌接种量10%,发酵时间48 h,即为实验组2,发酵后蜂花粉乳活菌数可达54.90×108cfu/g,感官评分为13.33,异丁酸含量3.60 mg/g。同时,总黄酮、总酚和DPPH清除率相较于对照组分别提高了94.17%、83.75%、106.45%;挥发酸种类更加丰富,总挥发酸含量增加到167.80 mg/g;还原糖含量增至48.70%。

2.5 验证实验

水分添加量50%,乳酸菌接种量10%,控制发酵温度37 ℃,进行蜂花粉发酵实验,厌氧发酵48 h后产品的乳酸菌活菌数为55.40×108cfu/g;感官评分13.67;总黄酮含量24.41 mg/g;总酚含量8.98 mg/g;DPPH清除率为49.08%;乳酸含量84.32 mg/g;甲酸含量11.89 mg/g;乙酸含量27.22 mg/g;丙酸含量35.52 mg/g;异丁酸含量3.32 mg/g;丁酸含量1.14 mg/g;异戊酸含量1.66 mg/g;戊酸含量1.80 mg/g;还原糖含量49.21%,说明所选最优工艺合理。

3 结论

采用蜂粮源乳酸菌Lactobacillussp. strain 2-3可以对蜂花粉进行厌氧发酵。以活菌数、感官评分为主要考察指标,在单因素基础上对厌氧发酵工艺进行优化,正交实验发现9个实验组的活菌数、感官评分、总黄酮、总酚、DPPH自由基清除率、甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、还原糖与对照组相比均有显著性差异(p<0.05),各指标相关性分析后选取活菌数、感官评分、异丁酸3个代表性指标做正交优化分析,最终得到的最优组合为水分添加量50%,发酵温度37 ℃,乳酸菌接种量10%,发酵时间48 h。厌氧发酵后的蜂花粉酸甜适口,富含益生菌,且提高了蜂花粉的抗氧化活性物质和还原糖含量,丰富了挥发酸的种类和含量,为蜂花粉的产品深开发提供了新思路。

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Optimization of the fermentation conditions of bee pollen with Lactobacillus sp. strain 2-3

WANG Cong1,2,3,HUANG Yan2,3,MA Shi-chun2,3,DENG Yu2,3,GUO Jun4,WU Zheng-yun1,*

(1.College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China; 2.Biogas Institute of Ministry of Agriculture,Chengdu 610041,China;3.Key Laboratory of Development and Application of Rural Renewable Energy,Ministry of Agriculture,Chengdu 610041,China; 4.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650504,China)

To improve the nutrition value of bee pollen,anaerobic lactic acid bacteria(LAB)Lactobacillussp. strain 2-3 from bee bread was used for bee pollen fermentation. The single factor test was studied,using the the number of living LAB and sensory value. Then,the number of living LAB,the sensory score,total flavonoids,total phenol,DPPH clearance,formic acid,lactic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid,isobutyric acid,valeric acid,isovaleric acid and revertose of the orthogonal 9 experiment group were tested. After the correlation analysis of indexes,representative indicators including the number of living LAB,the sensory score,isobutyric acid were selected to investigate the optimal anaerobic fermentation technology of bee pollen. The results showed that the optimal anaerobic fermentation technology of bee pollen was moisture of 50%,fermentation temperature of 37 ℃,LAB seed solution of 10%,fermentation time of 48 h,under this condition,the number of living LAB of fermented bee pollen was 54.90×108cfu/g,the highest sensory value was 13.33,and the isobutyric acid content was 3.60 mg/g. Besides,the flavonoids,total phenol and DPPH clearance of the optimum condition were increased by 94.17%,83.75% and 106.45%,respectively comparing with the control groups,the kinds of volatile acid was enriched with butyric acid and isobutyric acid,and the total content of VFA was increased to 167.80 mg/g,revertose content was increased to 48.70%. The results suggested that the LAB from bee bread was appropriate to apply to bee pollen,the nutrition value of bee pollen was improved.

Anaerobic;LAB;Antioxidant;Volatile acid;Revertose

2016-06-23

王聪(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：wangcong909209@sina.com。

*通讯作者:吴正云(1970-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生态工程与生物技术，E-mail：wuzhengyun@scu.edu.cn。

中国农业科学院科学与技术创新工程项目；四川省科技基础条件平台项目(TJPT20160013)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)23-0119-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.014