小檗碱对小鼠外阴阴道假丝酵母菌病的作用研究

丁晓媚宁玉梅王法明周笑梅李瑞兰

小檗碱对小鼠外阴阴道假丝酵母菌病的作用研究

丁晓媚1宁玉梅2王法明3周笑梅4李瑞兰5

目的观察小檗碱对小鼠外阴阴道假丝酵母菌病的治疗效果。方法ICR小鼠112只，采用雌激素化+阴道灌洗白假丝酵母菌菌液，构建外阴阴道假丝酵母菌病小鼠模型。随机分为正常组、模型组、实验组（小檗碱低、中、高剂量）和制霉菌素组，各18只，相应药物干预10天，观察小鼠在接菌后4、7、14天症状、体征、微生物学及组织病理学改变。结果接菌第7天，小檗碱高剂量组和制霉菌素组感染症状、体征消失，与模型组比较，小檗碱高剂量组真菌载量和阴道灌洗液真菌阴性鼠数均明显下降 [（1．83±0．75）104CFU/mL比（18．17±2．93）104CFU/mL，P＜0．05；5鼠比0鼠，P＜0．05]。小檗碱高剂量组和制霉菌素组效果相当[（1．83±0．75）104CFU/mL比（1．67±1．21）104CFU/mL，P＞0．05；5鼠比6鼠，P＞0．05]。结论小檗碱能有效治疗雌激素化小鼠外阴阴道假丝酵母菌病。

小鼠；外阴阴道假丝酵母菌病；白假丝酵母菌；小檗碱

近年来，外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）的发病率和复发率逐渐上升，寻找新的治疗外阴阴道假丝酵母菌病及预防其复发的药物已成为研究热点。本实验观察小檗碱对小鼠外阴阴道假丝酵母菌病的影响和作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 ICR品系小鼠（8～10周）112只，清洁级，雌性，体质量25～27g，由浙江省医学科学院动物中心提供。实验动物合格证号：SYXK（浙）2009－0129，自由饮水和摄食，环境温度20～22℃，相对湿度70%。

1.2 药物与试剂 盐酸小檗碱（批号110713－201010），每片含盐酸小檗碱0．1g；接种菌株（批号ATCC11106）均来浙江省新华医院细菌室。盐酸小檗碱阴道灌洗液配制：分别将1片盐酸小檗碱溶解于80、40、20mL的蒸馏水中，配制成药物浓度为0．125、0．25、0．5mg/mL药物。制霉菌素碱阴道灌洗液配制：将1片制霉菌素溶解于2mL的蒸馏水中，配制成药物浓度为25万U/mL药物。将配置好的药物消毒后置于4℃冰箱待用，每次每只小鼠取20μL灌洗阴道。

1.3 动物模型的构建及分组 随机选取小鼠94只，按赵敬军等[1]雌激素化+阴道灌洗白假丝酵母菌菌液（含白假丝酵母菌孢子数5×104个/20μL）法构建小鼠外阴阴道假丝酵母菌病模型。以小鼠外阴红肿，分泌物明显增加，见阴道口排出白色凝乳状分泌物，涂片镜检可见假菌丝及芽生苞子，为造模成功。其中4只涂片镜检未见假菌丝及芽生苞子，为造模失败。将造模成功的90只小鼠随机分为5组，每组18只：分别为小檗碱低剂量组（0．1mg/kg）、中剂量组（0．2mg/kg）、高剂量组（0．4mg/kg）、制霉菌素组（2万U/kg）、模型组，其余18只作为正常组。模型组和正常组予等体积蒸馏水溶液，其余予相应药物灌洗阴道。小鼠感染后的第4天开始阴道灌洗给药，1天1次，连续干预10天。

1.4 观察指标

1.4.1 阴道灌洗液检查 接菌第4、7、14天，各组分别取6只小鼠用无菌PBS液充分灌洗阴道，每只均取阴道灌洗液20μL，装于无菌试管中。从以下3方面进行观察：（1）混浊度；（2）真菌载量：将阴道灌洗液充分混匀，取其中的10μL加入490μL的无菌生理盐水之中稀释，后接种在改良后沙堡葡萄糖琼脂培养基上，37℃培养48h，进行CFU计数(即菌落形成单位，以个菌落/mL为单位计算)；（3）涂片镜检：剩余10μL进行涂片后镜检，整张涂片观察到的菌丝数量按以下标准分级：0：未见菌丝；+：＜10条菌丝；++：10～30条菌丝；+++：≥30条菌丝但未聚集成团；++++：1个假菌丝团；+++++：＞1个假菌丝团。

1.4.2 阴道组织病理检查 处死已取好阴道灌洗液的小鼠，在无菌操作下取小鼠的阴道组织，将取出的每个阴道组织用10%甲醛浸泡24h后作石蜡包埋、切片、染色（对同一标本同时做HE染色和PAS染色）。分别对HE染色的片子进行白细胞观察，PAS染色的片子进行菌丝观察。

1.5 统计学方法 应用SPSS13．0软件统计包，进行统计分析，计量资料采用（±s） 表示，两样本间进行成组LSD－q检验。对方差不齐或数据不呈正态分布的数据采用非参数检验。以P＜0．05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 症状及体征 正常组在整个实验中饮食正常，体质量无明显改变，未见有烦躁、外阴红肿、分泌物增加的现象出现。其余各组在接菌的第4天均出现饮食减少、烦躁，外阴红肿、分泌物增加、甚至有豆渣样乳白色分泌物流出。接菌第7、14天，小檗碱高剂量组、制霉菌素组感染症状及体征均消失。模型组在整个实验过程中症状、体征都呈持续状态。

2.2 阴道灌洗液检查结果

2.2.1 各灌洗日混浊度检查 正常组在整个实验过程中小鼠阴道灌洗液清澈。其余小鼠接菌第4天阴道灌洗液均混浊，见有豆渣样白带，模型组小鼠豆渣样白带一直持续到实验结束。接菌第7天，小檗碱高剂量组、制霉菌素组阴道灌洗液均未见明显的混浊；小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组仍见混浊，偶还可见豆渣样白带。

2.2.2 各灌洗日小鼠阴道灌洗液假丝酵母菌载量与正常组比较，模型组小鼠阴道灌洗液假丝酵母菌载量明显升高（P＜0．05）；接菌第7、14天，小檗碱中剂量组、小檗碱高剂量组、制霉菌素组阴道灌洗液假丝酵母菌载量比模型组均有明显减少（P＜0．05）。见表1。

表1 各组小鼠阴道灌洗液假丝酵母菌载量比较（×104CFU/mL±s）

表1 各组小鼠阴道灌洗液假丝酵母菌载量比较（×104CFU/mL±s）

注：与正常组比较，*P＜0．05；与模型组比较，△P＜0．05

?

2.2.3 各灌洗日小鼠阴道灌洗液镜检假菌丝 接菌第4天，实验组小鼠阴道灌洗液镜检假菌丝等级全部为+++～+++++，各实验组间比较P＞0．05。接菌第7、14天，各组阴道灌洗液镜检假菌丝等级比较：模型组与正常组比较P＜0．05；小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组与模型组比较，P＞0．05；小檗碱高剂量组、制霉菌素组与模型组比较，P＜0．05；小檗碱高剂量组与制霉菌素组比较，P＞0．05。接菌7～14天各组阴道灌洗液镜检菌丝等级情况见表2～3。

表2 接菌后第7天各组实验小鼠阴道灌洗液镜检假菌丝等级比较（只）

表3 接菌后第14天各组实验小鼠阴道灌洗液镜检假菌丝等级比较（只）

2.3 阴道组织病理学检查 实验过程中正常组小鼠阴道组织都未见菌丝及明显的白细胞浸润。其余各组小鼠接种白假丝酵母菌后第4天，在PAS染色下阴道黏膜即可见大量紫红色线状菌丝，有些有成团状及卵圆形孢子，但基本都只在黏膜的表面，未见明显向角质上皮穿透。在HE染色下见有PMNs浸润。接菌后第7天小檗碱高剂量组、制霉菌素组阴道腔内、阴道黏膜PAS染色下见菌丝大量减少且有见少量菌丝断裂的现象，镜下炎性细胞减少；小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组、模型组仍可见大量菌丝且有部分向角质上皮穿透，黏膜下可见大量的以PMNs为主的炎性细胞浸润。在接菌第14天小檗碱高剂量组、制霉菌素组中未见任何菌丝；小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组、模型组阴道腔内可见少量的菌丝断裂，但不明显。见图1～2（封二）。

3 讨论

外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）是由假丝酵母菌引起的一种常见的外阴阴道炎症性疾病。国内14家医院联合流行病学研究发现[2]，妇科门诊阴道炎患者中，VVC患者居首位。据国外流行病学资料统计[3]，5%的VVC患者每年发作4次或4次以上，成为复发性外阴阴道假丝酵母菌病（RVVC）。近年来，随着临床上抗生素的广泛使用、应用口服避孕药女性增多、糖尿病发病率增加等因素，致使VVC和RVVC的发病呈明显上升趋势。因其临床症状强烈、反复发作，易引起患者焦虑、抑郁等心理障碍，也增加了患者的经济负担。对RVVC患者进行抗真菌治疗常能收到满意的效果但并不能预防其复发，这使治愈RVVC成为临床上一个比较棘手的问题。小檗碱作为抗菌药在临床上已应用多年，其疗效确切，早在1969年Amin 等[4]就提出小檗碱是一种广谱抗菌药物，对多种革兰氏阳性、阴性菌以及真菌（如白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌）、霉菌、病毒、原虫、线虫具有抑制杀灭作用。赵民等[5]体外药敏研究显示，盐酸小檗碱体外具有抗假丝酵母菌活性。我们在前期的体外药敏试验中也证明小檗碱是有抑制白念珠菌的作用，其抑菌浓度为15．625μg/mL。本研究显示，小檗碱对小鼠外阴阴道假丝酵母菌病有明显治疗效果，0．4mg/kg用药剂量治疗效果与制霉菌素相当。

白假丝酵母菌具有孢子和菌丝两种形态，且在一定的条件下，孢子和菌丝可以相互转化。菌丝态的白假丝酵母菌更容易黏附于宿主黏膜，侵袭力和致病力都更强。致病真菌在代谢过程中可以产生前列腺素类物质，其中最主要的就是前列腺系E2 （PGE2）。Downward等[6]用质谱测定法证实白假丝酵母菌确实可由花生四烯酸代谢产生PGE2。Alem MA等[7]发现孢子和菌丝两种形态的白假丝酵母菌细胞在37℃均能合成前列腺系（PGAs），但菌丝形态的细胞分泌更多的PGs。菌丝较孢子可以通过自身代谢和刺激宿主产生更多的PGE2，同时PGE2可以促进孢子态向菌丝态转化[8－9]，菌丝形成后又可诱导宿主产生更多的PGE2[10]，刘亚莉等[11]也成功证实雌激素和白假丝酵母菌感染均可以诱导大量的PGE2产生，以上研究都证实PGE2在白假丝酵母菌性阴道炎中起着至关重要的作用。而毛秋娴等[12]用酶联免疫法（ELA）检测到PGE2浓度随盐酸小檗碱的浓度升高而降低，其作用机制可能是通过COX－1或结合型前列腺系E2合成酶－1（mPGES－1）的途径来影响PGE2的生成。小檗碱降低急性炎症组织中PGE2含量，是小檗碱抗炎的一种重要机制。赵民等[5]体外药敏研究显示，盐酸小檗碱体外具有抗假丝酵母菌活性。本实验显示，应用一定浓度小檗碱阴道灌洗的方法治疗雌激素依赖性外阴阴道假丝酵母菌病小鼠，小鼠炎性反应减轻，菌丝形成被有效抑制，且0．4mg/ kg小檗碱和制霉菌素组的治疗效果相同（P＞0．05）。而制霉菌素是目前临床最为经典的治疗VVC药物。说明小檗碱不仅在体外具有抗假丝酵母菌的作用，在体内也具有抗假丝酵母菌的作用而起到治疗VVC的作用，其机制可能为小檗碱可通过COX－1或mPGES－1的途径来减少PGE2的生成，但需要进一步研究来证实或发现是否有其它的抑菌机制。

［1］赵敬军，沈永年，陈伟，等.白念珠菌性阴道炎动物模型的构建［J］．中华皮肤科杂志，2002，5（10）：346－348．

［2］刘朝晖，廖秦平.小檗碱对外阴阴道假丝酵母菌病小鼠的疗效研究［J］．中国实用妇科与产科杂志，2005，4（21）：223－224．

［3］Centers for Disease Control and Prevention.Sexually Transmitted Disease Treatment Guidelines 2006［J］．MMWR，2006，55：（RR－11）54－56．

［4］Amin AH，Subbaiah TV，Abbasi KM.Berberine sulfate：antimicrobialactivity，bioassay，and mode of action［J］．Can J Microbiol，1969，15：1067－1076

［5］赵民，迟华基，牟文丽，等.盐酸小檗碱抗假丝酵母菌及抗肿瘤活性研究［J］．实用口腔医学杂志，2009，25（2）：193－196．

［6］Downward JRE，Nover MC.Characterization of Prostagland in E2 Production by Candida albicans［J］．Infect Immun，2007，75（7）：3498－505．

［7］Alem MA，Douglas LJ.Prostaglandin production during growth of Candida albicans biofilms［J］．J Med Microbiol，2005，54 （11）：1001－1005．

［8］Kalo-Klein A，Witkin SS.Prostaglandin E2 enhances and gamma interferon inhibits germtube formation in Candida albicans［J］．Infect Immun，1990，58（1）：260－262．

［9］Noverr MC，Huffnagle GB.Regulation of Candida albicans Morphorgenesis by fattyacid metabolites［J］．Infect Immun，2004，72（11）：6206－6210．

［10］Scott G，Basil o，Ashraf SI，et al.Mechanisms by Which Candida albicans Induce Endothelial Cell Prostaglandin Synthesis［J］．Infection and Immunity，1994，62（3）：1064－1069．

［11］刘亚莉，肖敦振，高俊，等.外阴阴道念珠菌病小鼠模型阴道组织PGE2的测定及消炎痛对其治疗的研究［J］．中国妇幼保健，2007，22（32）：4598－4599．

［12］毛秋娴，龙启才.盐酸小檗碱对LPS诱导的小鼠RAW 264．7细胞PGE2、COX－2表达的影响［J］．现代医院，2008，12（8）：7－9．

（收稿：2015-06-26 修回：2015-09-21）

Effect of Berberine on VulvovaginalCandidiasis of Mice

DING Xiaomei1,NING Yumei2,WANG Faming3,ZHOU Xiaomei4,LI Ruilan5． 1 Department of Traditional Chinese Medicine,People's Hospital of Lishui,Lishui (323000),China;2 Zhejiang Blood Center,Hangzhou(310000),China;3 Department of Rehabilitation,People's Hospital of Lishui,Lishui(323000),China;4 Department of Traditional Chinese Medicine,People's Hospital of Rui'an, Rui'an(325200),China;5 Department of Obstetrics&Gynecology,Xinhua Hospital,Hangzhou(310000),China.

ObjectiveTo investigate the effect of berberine on the treatment of vulvovaginal candidiasis（VVC）in mice．MethodsOne hundred and twelve mice was used to establish VVC by using estrogen and vaginal lavage fluid of white candida fungus．Ninety mice with VVC were randomly divided into blank control group,model group, experimental groups（lower,middle and high dose berberine）,and nystatin group,with 18 mice in each group．The treatment course lased for 10 d．In 4,7,and 14d after inoculation,signs and symptoms,microbiology test result and histopathological changes were observed in all groups．ResultsOn day 7 the signs and infection of VVC in high－dose berberine group and nystatin group disappeared;compared with model group,fungal load by microscopic examination was significantly decreased[（1．83±0．75）×104CFU/mL vs（18．17±2．93）×104CFU/mL,P＜0．05]and the number of mice with negative results was less in high－dose berberine group（0 mouse vs 5 mice,P＜0．05）．The treatment effect of high－dose berberine group was similar to that of nystatin group[（1．83±0．75）×104CFU/mL vs（1．67± 1．21）×104CFU/mL,P＞0．05]．ConclusionBerberine can effectively treat estrogen－dependent vulvovaginal candidiasis in mice．

mice；vulvovaginalcandidiasis；C．Albicans；erberine

浙江省中医药科技项目（No．2011ZA040）

1浙江省丽水市人民医院中医科（丽水 323000）；2浙江省献血管理中心（杭州310000）；3浙江省丽水市人民医院康复科（丽水 323000）；4浙江省瑞安市人民医院中医科（瑞安 325200）；5浙江省新华医院妇产科（杭州310000）

丁晓媚，Tel：18957090510