水飞蓟素逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF－7/ADM耐药性实验研究

陆一丹 徐良额 裘嘉琪 毛丹漪 刘晓谷 王大维

水飞蓟素逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF－7/ADM耐药性实验研究

陆一丹 徐良额 裘嘉琪 毛丹漪 刘晓谷 王大维

目的观察水飞蓟素（Silymarin，Sily）对人乳腺癌耐药细胞株MCF－7/ADM的逆转耐药作用。方法以CCK－8法测定阿霉素（Adm）对人乳腺癌敏感细胞株MCF－7/S和耐药细胞株MCF－7/ ADM的毒性作用，计算出耐药倍数。以无细胞毒性的Sily（10μg/mL）作为逆转耐药剂，联合Adm观察其对耐药细胞株MCF－7/ADM的逆转耐药作用，计算得逆转倍数。结果（1）Adm对MCF－7/S和MCF－7/ADM的半数抑制浓度（IC50）分别为1．773μg/mL和43．812μg/mL，耐药倍数为24．7倍。（2）Sily能够增强ADM对MCF－7/ADM的细胞毒作用。以10μg/mL（抑制率为2．0%）的Sily联合Adm作用于MCF－7/ADM 48h后，耐药细胞株的IC50降至7．798μg/mL，逆转倍数为5．6倍（P＜0．01）。结论Sily能够逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF－7/ADM的耐药性。

乳腺癌；耐药细胞株；水飞蓟素；逆转耐药

乳腺癌是实体瘤中应用化疗最有效的肿瘤之一，但由于多药耐药（multidrug resistance，MDR）现象的产生而导致化疗失败，并易引起的复发和转移，降低了许多抗癌药如阿霉素（adriamycin，Adm）的临床疗效。克服MDR的方法之一是使用逆转剂，由于逆转剂的人体生物利用度差或不良反应严重，导致逆转剂在临床举步维艰[1]，寻找高效低毒的耐药逆转剂是当前乳腺癌治疗的研究热点。本实验从天然植物中选择水飞蓟素（Silymarin，Sily）开展对Adm耐药性的研究。

1 材 料

1.1 细胞株 人乳腺癌细胞株MCF－7/S购自中科院上海细胞库，具有多药耐药表型的耐阿霉素细胞株MCF－7/ADM由浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所提供。

1.2 药物及试剂 Adm（浙江海正药业股份有限公司，批号H33021980）；Sily（80%）干粉（西安小草植物科技有限责任公司，批号XC20140423）。Adm用注射用葡萄糖水配成10mg/mL的工作母液，Sily干粉先用DMSO溶解为500mg/mL的工作母液（DMSO在无毒剂量内），分装后避光保存于－20℃冰箱，使用时用培养液配成相应浓度应用液。CCK－8（碧云天生物技术研究所，批号0703081421）。

2 方法

2.1 细胞培养 将敏感细胞株MCF－7/S置于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，在37℃、饱和湿度及5%CO2的细胞培养箱内传代培养。相应耐药株MCF－7/ADM连续培养在含1．0μg/mL的Adm的上述培养液中，培养条件相同。

2.2 MCF－7/ADM耐药细胞株对Adm耐药倍数的测定 实验分MCF－7/S+Adm、MCF－7/ADM+Adm组、空白组（只含培养液）、阴性对照组四组。取对数生长的MCF－7/S、MCF－7/ADM细胞悬液100μL分别接种于96孔培养板中，每孔细胞数均为2×105个，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育12h后加入不同浓度的Adm溶液（用FBS（－）RM1640培养液将10mg/mL的工作母液配成相应浓度应用液），敏感组Adm终浓度分别为0．16、0．8、4、20μg/mL和耐药组ADM终浓度分别为1、7、50、100μg/mL。同时设立只含RM1640培养液的空白对照和不加任何药物的阴性对照组，每组均设3个复孔，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育48h后弃去上清液，PBS清洗两遍，加入含10%CCK－8的RM1640培养液100μL/孔，作用3h后用酶标仪检测波长450nm时的OD值（吸光度）。计算Adm对敏感细胞、耐药细胞的半数抑制量IC50和耐药细胞对Adm的耐药倍数（耐药细胞IC50/敏感细胞IC50）。实验平行重复6次。

2.3 测定无细胞毒性剂量的Sily对MCF－7/ADM耐药细胞的逆转作用 实验分MCF－7/ADM+Adm、MCF－7/ADM+Adm+Sily、MCF－7/ADM+Sily三组。Sily剂量参考文献，定为10μg/mL[2]，每个浓度设3个复孔；空白和阴性对照组及余法同2．2．1。计算Adm对MCF－7/ADM细胞的IC50，与Sily的逆转倍数（逆转前IC50/逆转后IC50）。实验平行重复6次。

3 结 果

3.1 Adm对MCF－7/S，MCF－7/ADM的细胞毒性Adm对人乳腺癌MCF－7细胞系的细胞毒性作用与浓度呈正相关，但对敏感株和耐药株的效价差异巨大，如Adm在0．8μg/mL以上时就对MCF－7/S具有明显的细胞毒性作用（抑制率28．24%），而到50μg/ mL时对MCF－7/ADM的诱导凋亡作用仍较前者弱（抑制率14．69%）。见表1～2。MCF－7/ADM对Adm的抗肿瘤作用有明显的耐受性，耐药倍数（resistance index，RI）为24．7倍，见表4。

表1 Adm对MCF－7/S生长的影响（±s）

表1 Adm对MCF－7/S生长的影响（±s）

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表2 Adm对MCF－7/ADM生长的影响（±s）

表2 Adm对MCF－7/ADM生长的影响（±s）

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3.2Sily对MCF－7/ADM耐药细胞的逆转作用 MCF－7/ADM+Sily（10μg/mL）组结果是抑制率仅为2．0%，Sily10μg/mL对MCF－7/ADM为无细胞毒性剂量，排除了药物协同作用的干扰。Adm对MCF－7/ADM的细胞毒性作用因MDR被削弱，与Sily联合用药后，Adm的效价显著提高，见表3。IC50下降至7．798μg/ mL。Sily增强了Adm对MCF－7/ADM细胞的杀伤作用，提高细胞对Adm的敏感性，逆转耐药倍数（reversalfold，RF）为5．6倍，见表4。

表3 Sily对Adm抑制MCF－7/ADM生长的影响（±s）

表3 Sily对Adm抑制MCF－7/ADM生长的影响（±s）

表4 Sily逆转MCF－7对Adm耐药的结果（±s）

表4 Sily逆转MCF－7对Adm耐药的结果（±s）

注：与MCF7/S组比较，△△P＜0．01；与MCF－7/ADM组比较，**P＜0．01

4 讨 论

水飞蓟素是从菊科药用植物水飞蓟Silybum marianum L．Gaertn.种子的种皮中提取出来的一种黄酮木脂素类化合物，主要成分有水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭等黄酮类物质。研究[2－4]表明它具有促进胆汁分泌和消炎、保护肝脏、强抗氧化等作用。近年来，进一步研究发现Sily对膀胱癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌等均具有良好的抑制作用，其抗癌机制呈现多步骤、多靶点、全方位特点，并能增强动物机体细胞免疫功能，适合用于临床抗肿瘤药物研发。如Sily Sadava等[5]近期在人小细胞肺癌作用的研究中发现水飞蓟宾对人小细胞肺癌细胞株H69和耐药细胞株VPA17有近似的细胞毒性，IC50在60μM左右，没有耐药性，主要引起细胞G1期生长抑制，不影响细胞周期参数，通过激活caspase3的方式启动凋亡程序，诱导细胞凋亡；刘志刚等[6]研究发现，水飞蓟素可诱导人膀胱癌细胞 TCC、T－24的表达，使CDK2、CDK4和相关激酶的活性降低，使细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞增殖；此外，水飞蓟素还能诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤血管生成、抑制TNF所诱导的NF－kB激活等[7]；韩月恒等[1]经体外细胞实验发现水飞蓟素对乳腺癌MCF－7细胞有一定的抑制作用（IC50＜0．2%）；Rastegar等[8]在人乳腺癌MCF－7细胞系实验中，发现75μg Sily和Adm有协同效应，能够增强Adm的治疗效果，因此，Sily在较高剂量时能够抑制肿瘤细胞的增殖、影响其细胞周期的分布或诱导肿瘤细胞的凋亡，并对乳腺癌细胞有一定的抑制作用。

尽管如此，关于Sily对乳腺癌化疗逆转耐药性的研究鲜有报道，经本实验证实，Adm作用于MCF－7/ S、MCF－7/ADM时用量相差悬殊，说明体外培养的细胞状态下乳腺癌细胞的确存在对Adm耐药的情况；Sily能够逆转人乳腺癌耐药细胞MCF－7/ADM对Adm的耐药性，水飞蓟素与Adm联合用药后，增强Adm对乳腺癌耐药细胞株的杀伤作用，提高耐药细胞株对Adm的敏感性，相比其他文献记载中常用的一些逆转耐药中药制剂，如大黄素耐药逆转倍数为2．86[9]，粉防己碱为2．0[10]，西药中10μmol/L环孢素A 和1μmol/L雷帕霉素耐药逆转倍数均为1．6[11]，与本研究水飞蓟素的逆转耐药倍数5．7相差悬殊。可见水飞蓟素具有高效的逆转耐药作用。

此外，我们选用Sily 10μg/mL（抑制率2%）作为逆转耐药实验的研究剂量，结合文献记载粉防己碱在不产生细胞毒性时用药浓度一般在（抑制率≤5%）0．625μg/mL[10]，延胡索乙素则为2．5μg/mL[12]，远低于中药水飞蓟素。说明在不产生细胞毒性条件下，中药水飞蓟素用药浓度大于其他逆转耐药剂浓度，具有低毒的特点。Sily主要成分为有强抗氧化性的类黄酮，Soria等[13]通过研究Sily在砷（As）对乳腺癌细胞系MCF－7和ZR－75－1的抗癌作用发现，其能减少As对正常细胞的毒性作用而不干扰其抗肿瘤作用，建议Sily作为膳食抗氧化剂辅助癌症化疗。

综上，中药水飞蓟素不仅具有逆转乳腺癌耐药性，而且具有目前临床药物所缺乏的高效、低毒优势，有很大的研究价值。

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（收稿：2015－10－13 修回：2015－10－23）

Reversal Effect of Silymarin on Drug Resistant Breast CancerCell MCF-7/ADM

LU Yidan,XU Liange,QIUJiaqi,MAO Danyi,LIU Xiaogu,WANG Dawei．Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou（310053）,China

ObjectiveTo investigate the effect of silymarin on drug resistance of breast cancer cell line MCF－7/ADM．MethodsThe toxicant effect of adriamycin to MCF－7/S（sensitive strain）and MCF－7/ADM（drug－resistant strain）was measured by CCK－8 in vitrofor resistant index．Silymarin was screened in advance and the dose of 10 μg/ml was nontoxicant to MCF－7/ADM,then MCF－7/ADM was treated with this dose of silymarin（10μg/ml）to observe the reversal effect of silymarin．ResultsIC50 of adriamycin to MCF－7/S and MCF－7/ADM were 1．773 μg/ ml and 43．812μg/ml,respectively．Drug－resistant index of MCF－7/ADM was 24．7．Silymarin increased cell toxic effect of adriamycin．After treated with 10μg/mlsilymarin（inhibition rate was 2．0%）combining with adriamycin for 48h,IC50of adriamycine declined to 7．798μg/ml,and the reversal index was 5．6（P＜0．01）．ConclusionSilymarin could partly reverse drug－resistance of MCF－7/ADMto adriamycinein vitro．

breast carcinoma;drug resistance;silymarin;reversingdrug－resistance

浙江省大学生科技创新活动计划（新苗人才计划）项目（No．2014R410038）；浙江省中医药科技计划项目（No．2016ZB030）

浙江中医药大学（杭州 310053）

毛丹漪，Tel：18957130865；E－mail:danyimao@163．com刘晓谷，Tel：18858133126；E－mail：liuxiaogu@126．com