结肠癌组织C/EBPα表达及其对SW480细胞侵袭的影响

结肠癌组织C/EBPα表达及其对SW480细胞侵袭的影响

目的 研究结肠癌组织CCAAT/增强子结合蛋白－α（C/EBPα）的表达，及其过表达对结肠癌SW480细胞系侵袭性的影响。方法利用免疫组化方法检测48例结肠癌患者的癌组织与正常组织C/EBPα表达情况，并统计分析C/EBPα的表达与结肠癌临床病理参数之间的关系。构建pCDGFP－C/ EBPα真核表达质粒，通过细胞划痕实验观察转染对结肠癌SW480细胞系迁移能力的影响，并检测与肿瘤侵袭相关蛋白KLF5、MMP－2、MMP－9、ECD的的表达。结果免疫组化结果显示，正常组织C/ EBPα的低表达率为6．25%，而结肠癌组织C/EBPα的低表达率为68．75%，两组比较差异有统计学意义（P＜0．05），且低表达C/EBPα的患者肿瘤直径越大、TMN分期越晚、淋巴结转移概率越大。细胞划痕实验显示，划痕48h、72h后，正常SW480细胞的迁移率分别为53．16%、80．77%，而过表达C/EBPα 的SW480细胞的迁移率分别为23．57%、31．89%，两组比较差异有统计学意义（P＜0．05）；免疫印记实验表明，过表达C/EBPα的SW480细胞的KLF5、MMP－2、MMP－9表达明显降低，而ECD表达明显升高。结论C/EBPα在结肠癌组织低表达，且与结肠癌的TMN分期和转移有密切关系，C/EBPα过表达能够显著降低结肠癌细胞的侵袭性，对今后结肠癌的早期诊断和基因靶向治疗有重要指导意义。

结肠癌；C/EBPα；过表达；侵袭

结肠癌的发病率和病死率在全球恶性肿瘤中位居第三位[1－2]，且有逐年上升和年轻化的趋势[3－4]。结肠癌发病初期非常隐蔽，通常确诊时癌症已经发生侵袭和转移，影响临床治疗效果。所以，寻找结肠癌特异性生物分子标记物，抑制肿瘤侵袭，对其早期诊断和基因靶向治疗有着至关重要的意义。CCAAT/增强子结合蛋白－α（C/EBPα）广泛存在于人体的正常组织中[5]，而且高表达于肝脏、肺、脂肪组织及胎盘等组织中[6－7]。C/EBPα作为一种重要的转录因子，不但在抑制细胞增殖和促进细胞分化方面发挥着至关重要的作用[8－9]，在抑制肿瘤细胞的侵袭和转移方面也有显著作用[10]，因此其具有典型的抑癌基因特性。本文通过我院48例结肠癌患者的病理标本，观察C/ EBPα在结肠癌组织中的表达情况，及其表达与临床病理参数之间的关系；同时研究C/EBPα过表达对结肠癌细胞系SW480侵袭性的影响，为寻找结肠癌新的分子标志物和基因靶向治疗提供重要依据。

1 对象与方法

1.1 对 象 研究对象来源于我院肿瘤科2013年9月—2014年12月期间收治的48例结肠癌患者，其中男30例，女18例；年龄26～72岁，平均53．1岁；肿瘤直径≤5cm 22例，肿瘤直径＞5cm 26例；T1+ T2期 22例，T3+T4期 26例；无淋巴结转移21例，有淋巴结转移27例。患者均确诊为结肠癌，手术前均未接受放化疗治疗。取患者癌组织和癌旁正常组织（距癌组织边缘＞5cm）制成石蜡标本。

1.2 方 法

1.2.1 免疫组化 将蜡块进行切片、烤片（60℃，1h）、脱蜡（二甲苯+梯度乙醇）、复水（自来水+双氧水）、清洗（双氧水+蒸馏水）、微波修复（枸橼酸缓冲液）、清洗（PBS）、封闭（5%BSA，20min）、一抗孵育（37℃，1h或4℃过夜）、二抗孵育（37℃，0．5h）、SABC （37℃，0．5h）、DAB显色、苏木素复染、分化（盐酸+乙醇）、反蓝（氨水）、脱水（梯度乙醇+二甲苯）、树胶封片、镜检。结果评定标准：C/EBPα阳性表达为细胞膜和（或）细胞质内的淡黄色至棕黄色颗粒色。显微镜下随机选取5个高倍视野，计算视野中阳性肿瘤细胞的平均百分率。利用染色指数（SI）来表示染色结果，肿瘤细胞阳性率评分标准如下：4分：阳性率＞70%；3分：阳性率35%～70%；2分：阳性率10%～35%；1分：阳性率＜10%；0分：阳性率为0。染色强度评分标准如下：3分：棕色，强染色；2分：棕黄色，中度染色；1分：淡黄色，弱染色；0分：未见染色。SI为两者的乘积，0表示未表达C/EBPα；0＜SI≤4表示C/EBPα低表达；SI≥6表示C/EBPα高表达。

1.2.2 质粒构建 构建pCDGFP－C/EBPα真核表达质粒，引物为：F－CGCGGATCCGCGAGCCACCATGGAGTCGGCCGACT；R－CCGGAATTCCGGCGCGCAG TTGCCCATG，首先利用PrimeSTAR聚合酶、通过PCR技术从含有人C/EBPα的cDNA文库中扩增出C/EBPα的编码序列，并对PCR产物进行琼脂糖电泳并胶回收纯化，对纯化后的PCR产物进行双酶切（BamHI和EcoRI），同时对pCDGFP载体也进行相同的双酶切；然后利用T4连接酶对双酶切后的PCR产物和载体进行连接（16℃，12h），并利用大肠杆菌感受态（TG1）对连接后的产物进行质粒转化，倒置于37℃培养箱中培养，直到出现克隆（约10h）；然后用灭菌牙签挑取若干单克隆置于LB（氨苄抗性）培养基中振荡培养（37℃，250rpm），直到菌液变浑（约10h）；然后收集适量菌液，利用碱裂解法进行质粒抽提，并对抽提的质粒进行双酶切鉴定（BamH I和EcoR I）；最后选取鉴定正确的一管质粒进行DNA测序。

1.2.3 细胞培养 人结肠癌细胞系SW480购于百恩维生物科技有限公司，并长期保存于液氮中，实验前对细胞进行复苏，并用含有5%胎牛血清、10% FBS、青链霉素的DMEM培养基进行培养（37℃，5% CO2），每日定时观察细胞状态，及时更换培养液，待细胞的融合度达到90%以上时，对细胞进行传代，并以适当密度重新进行接种，取对数期细胞进行转染实验，实验完成后，冻存细胞。

1.2.4 细胞转染 实验采用脂质体转染法，首先准备对数期 SW480细胞和浓度约为 500ng/μL的pCDGFP－C/EBPα质粒，然后取适量转染液（Opti－MEM）分别稀释lip2000（15μL）和质粒（5μg），静置5min后，将它们温和混匀，再静置20min，将混合液轻轻加入细胞中，培养4～6h后，更换完全培养基，继续培养24～72h，每隔24h换液1次。

1.2.5 细胞划痕实验 分别对转染了pCDGFP－C/ EBPα及未转染的SW480细胞进行划痕实验，在转染6h换液后，用枪头垂直在细胞面划直线，并用PBS清洗2～3次，洗去划下的细胞，然后继续培养，定期换液，并在0、24、48、72h 4个时间点观察细胞的迁移运动情况，每个视野下选取10个观测点，准确记录迁移起点到最远点的细胞间距，求平均间距，并通过以下公式计算各组细胞不同时间点的迁移率：迁移率=（划痕初始宽度值－各时间点划痕宽度值）/划痕初始宽度值×100%。

1.2.6 Western blot分析 转染48h后取出SW480细胞，用预冷的PBS清洗2～3次，胰酶消化，低速离心收集细胞，加入适量的细胞裂解液重悬细胞，4℃混匀30min，低温高速离心收集上清，取适量加入等量的SDS上样缓冲液（2×），沸水浴10min后置冰水中冷却；取适量样品上样，SDS－PAGE电泳（100V，2h），恒压湿转（100V，1h）；5%的脱脂奶粉或BSA溶液封闭1－2h；KLF5/MMP－2/MMP－9/ECD兔多克隆抗体（1︰500）4℃孵育过夜或室温孵育2h，TBST溶液洗膜3次；HRP山羊抗兔IgG二抗（1︰10000）室温孵育1h，TBST溶液洗膜；暗室中进行显影。比较转染了C/EBPα之后，KLF5/MMP－2/MMP－9/ECD表达的变化。

1.3 统计学方法 应用SPSS软件对统计数据进行分析，计量数据采用均数±标准差（±s） 表示，组间对比采用配对t检验，计数资料采用比例表示，组间比较采用卡方检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C/EBPα在结肠癌与正常癌旁组织的表达 对48例患者的结肠癌病理组织与正常组织进行免疫组化实验，利用染色指数评定C/EBPα的表达情况。48份正常组织，仅有3份显示C/EBPα未表达或低表达，其余45份显示C/EBPα高表达，低表达率为6．25%；48份结肠癌病理组织，有33份显示C/EBPα的未表达或低表达，其余15例显示C/EBPα高表达，低表达率达68．75%。与正常组织相比，结肠癌组织中C/EBPα的表达量明显降低（P＜0．05）。

2.2 C/EBPα表达和结肠癌临床病理参数的关系48例结肠癌中，C/EBPα的表达与结肠癌患者的性别、年龄等临床病理参数无关，但和结肠癌的肿瘤直径、TNM分期和淋巴结转移有密切关系（P＜0．05），见表1。

2.3 pCDGFP－C/EBPα质粒的酶切鉴定 对重组质粒pCDGFP－C/EBPα进行BamH I、EcoR I双酶切，第2泳道的重组质粒pCDGFP－C/EBPα酶切后得到两条亮带，通过与pCDGFP酶切产物、C/EBPα的PCR产物以及Marker的横向对比表明，一条亮带是载体pCDGFP（6100bp），另一条亮带是目的片段C/ EBPα（1077bp），表明该质粒成功连接。后续的测序结果也表明连接正确。酶切鉴定的结果见图1。

表1 结肠癌C/EBPα表达和结肠癌临床病理参数的关系[（例）%]

图1 重组质粒pCDGFP-C/EBPα的双酶切鉴定

2.4 过表达C/EBPα对结肠癌SW480细胞迁移力的影响 细胞划痕24h后，未转染组和转染组的细胞迁移率比较差异无统计学意义（P＞0．05）；划痕48、72h后，未转染组和转染组的细胞迁移率差异有统计学意义（P＜0．05）。C/EBPα过表达显著降低结肠癌SW480细胞的迁移力，见表2。

表2 PCDGFP－C/EBPα转染对结肠癌SW480细胞迁移力的影响（%±s）

表2 PCDGFP－C/EBPα转染对结肠癌SW480细胞迁移力的影响（%±s）

注：与未转染组比较，*P＜0．05

2.5 过表达C/EBPα对肿瘤侵袭相关蛋白表达的影响 在结肠癌SW480细胞中过表达C/EBPα后48h收紧细胞进行WB实验，检测与肿瘤侵袭有着密切关系蛋白（KLF5、MMP－2、MMP－9、ECD）的表达情况，抗体免疫结果显示，与未转染组相比，过表达C/ EBPα组的KLF5、MMP－2、MMP－9蛋白表达量明显下降，而ECD的蛋白表达量明显升高。结果表明，过表达C/EBPα能够明显降低促进肿瘤侵袭相关蛋白的表达，进而起到抑制肿瘤侵袭的作用。见图2。

图2 肿瘤侵袭相关蛋白表达图

3 讨 论

肿瘤侵袭转移是指癌细胞离开原发灶后侵犯周围组织并不断增殖，最终形成新肿瘤的过程，是恶性肿瘤最为重要的生物学特性。CCAAT/增强子结合蛋白-α（C/EBPα）是C/EBP转录因子家族中首个被发现的成员[11]，该基因位于19q13.1染色体上，其编码p42和p30两种异构体蛋白，由于p30缺失了氨基末端，无法抑制E2F下游靶基因的表达，也就失去了抑制细胞增殖的功能。而p42作为一个完整的转录因子，具有抑制细胞增殖、促进细胞分化、阻止肿瘤转移等抑癌功能[12-13]，已在肝癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌等癌症中发现C/EBPα表达量降低的现象[14-15]。

本研究发现，结肠癌组织中C/EBPα低表达，与结肠癌的肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移有密切关系，提示C/EBPα低表达可能与结肠癌的侵袭和转移有关。通过观察C/EBPα的表达对结肠癌SW480细胞侵袭性的影响，发现过表达C/EBPα 48h后的SW480细胞的侵袭性显著减弱。而过表达C/EBPα之后，SW480细胞中KLF5、MMP-2、MMP-9也表达量显著降低，ECD的表达量显著升高。研究[16-18]报道, KLF5、MMP-2、MMP-9的过量表达，ECD的低表达都将促进结肠癌细胞的侵袭，与本文研究结果一致。综上，C/EBPα与结肠癌的发生、发展有密切关系。

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（收稿：2015-06-16 修回：2015-09-18）

Expression of C/EBPαin Colon Cancerand Its Effects on Invasion of SW480

CHEN Xuquan1,NI Yanle1,ZHOU Hongzhong2,ZHANG Zhiyong1,YE Long1． 1 Department of Surgery,the Second People's Hospital of Leqing,Leqing(325600),China;2 Department of Gastrointestinal Surgery,the First Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Wenzhou(325000),China

ObjectiveTo study the expression of C/EBPα in colon cancer tissues and the effect of its over－expression on invasion of SW480．MethodsThe expression level of C/EBPα was detected in cancer tissues and normal tissues from 48 patients with colon cancer by immunohistochemistry．The relationships between theexpression of C/EBPα and clinicopathological parameters of colon cancer were statistically analyzed．pCDGFP－C/EBPα eukaryotic expression vector was constructed and transfected into SW480to study the change of invasive ability of tumor cells by wound scratch assay and to detect the change of tumor invasion－associated protein（KLF5,MMP－2,MMP－9, ECD）expressions．ResultsImmunohistochemistry results showed that the rate of low expression of C/EBPα was 6．25%in normal tissues and 68．75%in colon cancer tissues,with a statistically significant difference between them （P＜0．05）．Patients with low expression of C/EBPα hada larger tumor diameter,later stages of the TMN and higherprobability of lymph node metastasis．Wound scratch assay showed that the migration rate of normal SW480 cells was 53．16%after 48h and 80．77%after 72h（P＜0．05）;the migration rate of SW480 cells that overexpressed C/ EBPα was 23．57%after 48h and 31．89%after 72h（P＜0．05）．Immunoblotting experiments also showed that the expression of KLF5,MMP－2,MMP－9 was significantly decreased,but ECD was significantly increased in SW480 cells with overexpressed C/EBPα．ConclusionThe expression of C/EBPα reduces in colon cancer,and it has a close relationship with TMN staging and migration．The overexpression of C/EBPα can significantly reduce the invasion of colon cancer cells and hence it may have a great significance on early diagnosis and targeted therapy of colon cancer in the future．

colon cancer;C/EBPα;overexpression;invasion

浙江省乐清市软课题与社会发展项目（No．2014Y005）

浙江省乐清市第二人民医院外科（乐清 325600）；2温州医科大学附属第一医院胃肠外科（温州 325000）

陈旭权，Tel：13806606853；E－mail：chenxunquan1972@163．com