北方须鳅性腺发育的组织学观察

2016-02-07魏洪祥骆小年徐忠源王新荣

水产学杂志 2016年5期

魏洪祥，骆小年，徐忠源，王新荣

（1.辽宁省淡水水产科学研究院，辽宁辽阳 111000；2.辽宁省新宾县红升水库管理所，辽宁抚顺 113202；3.辽宁省新宾满族自治县水产技术推广站，辽宁抚顺 113202）

北方须鳅性腺发育的组织学观察

魏洪祥1，骆小年1，徐忠源2，王新荣3

采用组织学方法观察辽宁太子河上游体长5～11cm的北方须鳅Barbatula nuda性腺发育的组织形态结构。结果表明：北方须鳅的精巢属于小叶形，分为6个发育期，精子的发生分为5个时相：精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和成熟精子；卵巢发育分为6个时期，卵子的形成分为5个时相：卵原细胞、初级卵母细胞前期、初级卵母细胞后期、次级卵母细胞、成熟卵子。夏季水温较高时，北方须鳅迅速积累营养物质，精巢当年秋冬季节达到Ⅳ期，次年三、四月即可繁殖，较非冷水性鱼类提前1～2个月。

北方须鳅；性腺；组织学

北方须鳅Barbatula nuda隶属鲤形目Cypriniformes鳅科Cobitidae须鳅属Barbatula，主要分布于俄罗斯鄂毕河以东的西伯利亚地区和远东地区，日本、朝鲜以及我国的西北、东北等地区也有分布[1,2]；它生活在水质清澈、温度低、溶氧充足的水体中，常隐藏在河流的砂石下面，不集群，为小型喜冷水性鱼类[3,4]；在天然水域，主要以甲壳动物、昆虫及附生藻类为食。北方须鳅肉质细嫩，味道鲜美，深受人们喜食，自然资源量越来越少。有学者研究了北方须鳅的外部形态、生物学[5-7]及分类[8]等，但对北方须鳅性腺发育的研究却鲜见报道。本文通过研究北方须鳅性腺发育的组织学周年变化，旨在为北方须鳅的繁殖生物学提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

2014年7月～2015年7月，在太子河上游的辽宁省新宾满族自治县平顶山镇采集160尾北方须鳅，体长5～11cm，体质量1.86～36.7g。

1.2 方法

挑取体长由大到小的鱼体样本，解剖摘取性腺，分前、中、后取长约5mm的组织用Bouin′s液固定，用梯度浓度的酒精脱水处理，再用Leica EG 1150型石蜡包埋机包埋，然后用Reichert-Jung 820旋转切片机切片。切片厚5～7μm，经苏木精-曙红（HE）染色后，在Leica DM750光学显微镜下观察、测量及拍摄。按照参考文献[9-11]的描述，对性腺进行分期。

2 结果与分析

2.1 精巢发育的外形分期

精巢成对，位于腹腔内消化道背面，紧贴于肾脏上。不同发育阶段的精巢形状、色泽等外部特征不同，以此分为6个发育时期：I期，精巢细长线形，淡粉色，紧贴于腹腔壁上，仅从外部特征肉眼无法分辨雌雄；Ⅱ期，精巢细长带状，淡粉色半透明，血管不明显，肉眼可以分辨出雌雄；Ⅲ期，精巢加厚，呈圆锥状，淡黄色，可见血管分布；Ⅳ期，精巢明显变厚，呈细棒状，乳白色，有明显的血管分布；V期，精巢外形已经成熟，形状与Ⅳ期相近，也呈细棒状，乳白色，质地柔软，轻轻用手按压腹部，可见有乳白色精液从生殖孔流出；Ⅵ期，精液已大量排出，精巢体积大幅萎缩而松弛，乳白色带红，布满微血管。

2.2 精子发生的组织学观察

北方须鳅的精巢是小叶型组织结构，小叶外层包埋于结缔组织和生殖上皮中。小叶间质由成纤维细胞、微血管和间质细胞等构成，把小叶分开。北方须鳅的精子发生主要经历精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、成熟精子五个时相。

2.2.1 精原细胞时相

I期精巢由初级和次级精原细胞构成。初级精原细胞数量不多，但体积较次级精原细胞大，核仁更加明显且大，经多次有丝分裂后形成大量次级精原细胞。次级精原细胞体积较初级精原细胞稍小，核膜不明显，核质呈点状分布（图版I-1）。

2.2.2 初级精母细胞时相

Ⅱ期精巢主要由初级精母细胞构成。初级精母细胞由次级精原细胞分裂而来，形状与次级精母细胞相似但体积略有增大。核内染色质呈线型，准备下一次成熟分裂。组织学观察发现，小叶仍紧密排列在一起，但是精小叶间出现了小叶腔，数目较少。HE染色后观察发现，初级精母细胞核仁和核膜被染成深蓝色，而胞质染成淡红色。

精巢初次发育到Ⅱ期的形态与繁殖后再发育至Ⅱ期的精巢有明显的区别：前者精巢内小叶腔体积较小，含有较多的初级精母细胞，腔内没有退化的精子或精子细胞；后者精巢内小叶腔体积较大，初级精母细胞的数量较少，腔内有大量退化的精子或精子细胞（图版I-2）。

2.2.3 次级精母细胞时相

Ⅲ期精巢由少量的初级精母细胞和大量的次级精母细胞共同组成。此时的次级精母细胞由初级精母细胞经过减数分裂而来，染色体的数目减少一半。小叶腔中还有少量的精子。次级精母细胞具有较强的嗜碱性。小叶腔数目明显增多，体积明显增大（图版I-3）。

2.2.4 精子细胞形成时相

Ⅳ期精巢主要由精子细胞组成。次级精母细胞经有丝分裂产生两个体积更小的精子细胞，精子细胞的体积比次级精母细胞小很多，细胞器逐渐消失。小叶腔内仍存少量的精子，小叶腔体积进一步扩大，相邻的小叶腔之间开始融汇贯通并形成通道（图版I-4）。

2.2.5 精子成熟时相

V期精巢内主要是经一系列复杂发育过程变化而来的成熟精子。此时相的精小叶间没有界限，精子通道完全形成。发育成熟的精子溢出流至小叶腔，小叶腔内充满成熟的漩涡状精子流。精子头部呈圆颗粒状，嗜碱性较强，HE染色呈深蓝色。尾部细长状，HE染色呈浅蓝色。小叶间隙呈淡红色（图版I-5、图版I-6）。

2.3 卵巢发育的外形分期

北方须鳅的卵巢为1个，位于消化道的背面，紧贴肾脏。根据形状和外部特征，将卵巢的发育分为5个时期：I期，紧贴在腹膜上，细线状，半透明，肉眼不能分辨雌雄，看不到卵巢内的血管；Ⅱ期，卵巢扁带状，半透明，表面血管不明显，中间略厚两端变窄；Ⅲ期，卵巢体积明显扩大，扁平囊状，宽度和厚度显著增加，可见卵粒，血管分布明显；Ⅳ期，卵巢体积进一步扩大，呈梭状，表面血管粗且明显，布满整个卵巢表面，卵巢膜明显增厚，卵粒明显但不易分开；V期，卵巢饱满但体积没有增大，轻压腹部，卵粒即从生殖孔流出；Ⅵ期，卵巢中卵子大部分产出，体积明显缩小，卵巢松弛，表面充血。

2.4 卵子发生的组织学观察

根据卵子产生过程中卵巢组织变化、细胞体积、卵黄物质的产生过程等特征，将北方须鳅卵子发生分为5个时相。

2.4.1 第Ⅰ时相

系卵原细胞向初级卵母细胞的过渡时期。卵巢内主要由位于生殖上皮的卵原细胞或由卵原细胞向初级卵母细胞过渡的细胞组成。细胞体积最小，细胞质少，细胞核大，核质比大。

2.4.2 第Ⅱ时相

系初级卵母细胞的小生长期。卵母细胞的体积比卵原细胞大得多，随着发育，卵母细胞间体积相差较大。卵母细胞形状不规则，多圆形。细胞核嗜酸性，HE染色为浅粉色。细胞质嗜碱性，HE染色呈蓝紫色。核仁开始为单个，紧贴核膜，随着细胞发育，数目逐渐增多，大小不一。卵母细胞之间有卵原细胞分布。出现滤泡细胞（图版I-7）。

2.4.3 第Ⅲ时相

系初级卵母细胞的大生长期。卵母细胞体积进一步增大，细胞质嗜碱性减弱，HE染色由原来的蓝紫色变为浅蓝色；早期胞质边缘开始出现卵黄泡，中期卵黄泡逐渐由单层变为多层，卵黄泡内开始积累卵黄颗粒，后期随着细胞发育，卵黄泡和卵黄颗粒数目增多；细胞外出现放射带。滤泡细胞单层，扁平状（图版I-8、图版I-9、图版I-10）。

2.4.4 第Ⅳ时相

随着发育，卵母细胞的体积增大至最终大小。大部分细胞为圆形或椭圆形，营养物质的积累终止，卵黄颗粒布满卵母细胞，卵黄颗粒嗜酸性，经HE染色呈粉红色。细胞核向动物极偏移。大部分未积累卵黄物质的卵黄泡被挤至卵膜内缘，放射带增厚至最大。滤泡层由两层细胞组成，厚度大幅度增加，内层厚度与放射带相同，由单层柱状细胞紧密排列，外层由单层扁平细胞组成（图版I-11）。

2.4.5 第V时相

由卵母细胞经过成熟分裂向次级卵母细胞过渡的阶段。卵母细胞充满开始融合的卵黄颗粒，移到动物极；细胞核的核膜完全消失并进入第一次成熟分裂，排出第一极体，继而进入第二次成熟分裂期。放射带明显。卵粒从放射膜同滤泡层之间脱离并落入卵巢腔中，即排卵（图版I-12）。

3 讨论

3.1 北方须鳅精巢及精子发育的特点

根据Nagahama[12]和Billard[13]对硬骨鱼类精巢类型的划分方法，北方须鳅精巢和其他理科鱼类一样也为小叶型（lobular type），进入生殖季节时，相邻精小叶的壁逐渐破裂，精子外泄，充满小叶腔，小叶腔之间互相连通构成精子向外流出的通道，最靠近输出管的小叶腔向输出管开口，成熟精子就由此进入输出管。

鱼类的性腺发育成熟及繁殖活动受体内生理调节和外部营养、光照和水温等环境条件影响[14]。北方须鳅样本采集点地处太子河上游的山间溪流中，水质清冷、溶氧充足，其性腺发育与一般非冷水性养殖鱼类的性腺发育不同。北方须鳅精巢的发育与卵巢一样，在夏季水温较高时迅速积累营养物质并发育，精巢发育到当年的秋冬季节就已达到Ⅳ期，次年三月或四月繁殖，较非冷水性养殖鱼类的繁殖季节提前1～2个月[15,16]。

3.2 北方须鳅卵巢及卵子发育的特点

鱼类的产卵类型分为一次性产卵、分批产卵及连续产卵等三种类型[17]。一般认为，鲤Cyprinus carpio、鲫Carassius auratus属非同步，一年可产卵二或三次；而鲢Hypophthalmichthys molitrix、鳙Aristichthys nobilis、草鱼Ctenopharyngodon idellus、青鱼Mylopharyngodon piceus属同步，一年产卵一次；尼罗罗非鱼Tilapia nilotica和短盖巨脂鲤Piaractus brachypomus属典型的分批非同步，一年产卵数次[18]。北方须鳅卵巢的组织切片观察表明，在V期卵巢中的卵母细胞绝大部分都处于第V时相，其周围仅有极少量处于第Ⅱ时相的卵母细胞，说明北方须鳅属一次性产卵鱼类。影响鱼类性腺发育的综合因素包括营养、温度、盐度、光照、水流，及溶氧等[18]。本研究中，2014年10月所采集到的北方须鳅样本中大部分卵巢已达Ⅳ期，卵巢发育饱满，这和大部分非冷水性养殖鱼类五月发育到Ⅳ期不同。青鱼、草鱼、鲢、鳙等鲤科养殖鱼类在秋冬季性腺处于Ⅱ期或Ⅲ期，正在进行营养的积累，22～28℃为其性腺发育和成熟的适宜水温，水温低于18℃性腺发育速度缓慢，往往停止在第Ⅲ期或第Ⅳ期初而不向第Ⅳ期末过度。这是因为北方须鳅属溪流冷水性鱼类，繁殖期在三月底至四月中旬，较一般鱼类提早2个月以上，因此不需要多久卵巢就发育到V期，即可完成成熟产卵过程。

北方须鳅第Ⅰ时相和第Ⅱ时相的卵母细胞与其他硬骨鱼类卵母细胞没有区别，第Ⅲ时相时，在靠近细胞膜的细胞质周围出现卵黄泡，卵膜的内周和核周开始出现卵黄颗粒，细胞外的放射膜和滤泡膜逐渐增厚。卵母细胞在第Ⅳ时相早期胞质中不断出现大量的卵黄颗粒，伴随着卵母细胞的不断发育，后期的卵母细胞充满卵黄颗粒。当卵母细胞发育至第V时相时，细胞核开始出现极化，细胞核移到动物极，核膜溶解，核质与细胞质混合在一起，此时细胞也完全脱离了滤泡膜。未成熟或未产出的卵母细胞最后退化被吸收[19-21]。

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Observation of Gonadal Development of Loach Barbatula nuda

WEI Hong-xiang1,LUO Xiao-nian1,XU Zhong-yuan2,WANG Xin-rong3
（1.Freshwater Fisheries Research Academy of Laoning Province,Liaoyang 111000,China; 2.Hong Sheng Reservoir Administration in Xinbin County,Liaoning Province,Fushun 113202,China; 3.Fisheries Technology Extension Station of Xinbin Manchu Autonomous County,Liaoning Province,Fushun 113202,China）

Histological observation of gonadal development was conducted in loach Barbatula nuda with body length of 5～11 cm collected in the upper reaches of Taizi River in Liaoning province by a histological method.The results showed that the loach had lobular testes whose development divided into 6 stages,and 5 subphases of spermatogenesis including spermatogonia,primary spermatocyte, secondary spermatoeyte,spermatid,and spermatozoon.The ovary development was divided into 6 stages and the oocyte development was divided into 5 stages including oogonium,earlier primary oocyte,later primary oocyte,secondary oocyte,and ovum.Loach began to rapidly accumulate of nutrients at high temperature in summer,and had testis with stageⅣin autumn and winter and spawned in the next March and April,1～2 months earlier than non-coldwater fishes.

Barbatula nuda;gonad;histology