RNA干扰MSTN基因鲤的肌纤维密度及染色体核型分析

闫学春，栾培贤，何立川，吴学工

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

RNA干扰MSTN基因鲤的肌纤维密度及染色体核型分析

闫学春，栾培贤，何立川，吴学工

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

本实验分析RNA干扰MSTN基因鲤（以下简称RNA干扰鲤，体质量为116.2g和110.3g）的染色体，测定该鲤肌肉中的肌纤维密度。结果表明：（1）三组实验鱼的肌纤维密度分别为163.7根/mm2、171.9根/mm2和162根/mm2，对照鱼的普通鲤（Common carp）为142根/mm2，实验鱼高于对照鱼。单因素方差分析表明：实验鱼组间肌纤维密度差异不显著（F=0.83，P=0.44＞0.05），而与对照鱼差异显著（F=5.24，P=0.034＜0.05）。（2）PHA和秋水仙素体内注射法分析核型表明，实验鱼的染色体数为2n=100，核型公式为：2n=30m+24sm+28st+18t，臂比（NF）156，对照鱼染色体数为2n=100，核型公式为：2n=30m+26sm+28st+16t，臂比（NF）156。结果说明RNA干扰基因的插入并未影响鲤染色体组成。

RNA干扰；MSTN；肌纤维密度；染色体核型

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）介导的抑制基因表达的现象，引发RNA干扰现象的RNA称为干扰RNA。在后基因组时代，RNA干扰技术作为一种抑制基因表达的基因沉默技术，可以特异性抑制目的基因表达，现已成为基因功能研究中的一种快速、简便的有效方法[1]。1998年，Fire等[2]在研究线虫基因沉默时，证实RNA干扰现象由双链RNA介导完成，随后证明RNA干扰现象广泛存在于多种真核生物中，如植物、真菌、果蝇、动物等。RNA干扰引起特定基因沉默主要有转录前水平的基因沉默（TGS）和转录后水平的基因沉默（PTGS）两类：TGS是通过DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录；PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制，已在鱼类研究中有很多报道[3-9]。目前有两种常用方式实现RNA干扰：1）构建DNA表达载体导入受体细胞，通过在体内表达合成dsRNA；2）采用体外合成可诱导基因沉默的dsRNA，再通过适当的手段导入受体细胞或机体。二者不同之处在于产生可诱导基因沉默dsRNA的方式，但其目的都是使目的基因表达水平下降或者完全沉默。

肌肉生长抑制素（MSTN）属TGF-β超家族，是一类分泌型的多肽。1997年Mcpherron等[10]首次在小鼠骨骼中发现了MSTN基因。该基因对骨骼肌生长起负调节作用，抑制肌肉发育。近些年许多学者都致力于研究不同物种肌肉生成抑制因子[11-13]，试图通过实验方法导致MSTN基因突变使肌细胞的增殖和肥大。在鱼类中，Acosta等[14]在斑马鱼Barchydanio rerio var中发现，通过RNAi沉默MSTN基因，抑制了MSTN基因表达解除其对斑马鱼肌肉生长的抑制作用，促进了斑马鱼的生长。

本文通过显微注射技术将携带H1启动子的RNA干扰真核表达载体导入鲤受精卵核区附近，获得一批具有MSTN基因沉默表型的RNA干扰鲤，实验证明该鲤比普通鲤生长速度快[7]。MSTN基因对肌肉生长起负调节作用，通过RNA干扰沉默MSTN基因能够解除对肌肉生长的抑制作用，引起肌肉纤维密度变化。RNA干扰还能引起染色体异染色质化，引起核型改变。本研究利用肌肉纤维密度测定技术和核型分析技术分析RNA干扰鲤，探究RNA干扰MSTN基因对鲤肌肉纤维纤维密度和核型的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

实验鱼为黑龙江水产研究所制备的RNA干扰鲤，对照鱼为普通鲤（Common carp），取自黑龙江水产研究所松浦试验站。实验鱼和对照鱼饲养在两个333.3m2的相邻池塘中，每个池塘各放800尾同期孵化的鱼苗，采用相同的喂养方法，饲养102d。

1.2 方法

1.2.1 肌纤维密度测定

实验鱼15尾，平均体质量为140g，随机分成三组。对照鱼共取5尾，平均体质量为138g。取实验鱼和对照鱼的背鳍下方、侧线上方的肌肉（去鳞、去皮），样品大小为1cm×1cm×0.5cm，平放入Bouin氏液中固定，采用石蜡包埋切片，厚度为8μm，切面与肌肉纤维方向垂直，苏木素-伊红染色，常规封片，每个样品3张，在光学显微镜下进行观察[19]。

在Olympus CN2.0显微镜目镜中放入网格测微尺，在10×40倍下使用Motic plus2.0测量软件测定肌纤维密度，每片取30个视野，记录视野网格内肌纤维根数[20]。

1.2.2 核型分析

实验鱼和对照鱼各10尾，平均体质量分别为116.2g和110.3g，在实验室内室温充气暂养。实验前一天注射PHA（植物凝集素），剂量为200g/g鱼体质量。注射PHA后18h，活体胸腔注射秋水仙素，剂量为50μg/g鱼体质量，注射4 h后将鱼处死取前肾[21]。

将前肾放入生理盐水中研磨，将细胞悬液吸入离心管中，1 000r/min离心6min，将上清液吸出，用低渗液悬浮沉淀，处理30min，在离心、悬浮等处理后用卡诺氏液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定三次，每次30min[22]。

将载破片从冰水中取出，每片滴三滴肾悬浮液，待干燥后，用Giemsa染色液染色20min。用自来水细流冲洗片子，室温干燥后进行核型分析。

核型分析时，取10个染色体分散较好的中期分裂相计数以确定染色体数目，在显微镜的油镜下照相、测量、统计[23]。

2 结果与分析

2.1 肌纤维密度

在光镜下观察发现，三组实验鱼和对照鲤的肌纤维密度分别为163.7根/mm2、171.9根/mm2、162根/mm2和142根/mm2（图1）。单因素方差分析表明，实验鱼组间肌纤维密度差异不显著（F=0.83，P=0.44＞0.05），而实验鱼与对照鱼之间肌纤维密度差异显著（F=5.24，P=0.034＜0.05）（图2和图3）。

2.2 RNA干扰鲤的染色体数目

图1 RNA干扰鲤肌纤维密度比较Fig.1 Comparison of muscle fiber density in the RNA interference common carp

图2 RNA干扰鲤肌纤维显微切片图Fig.2 The muscle fibers of the RNA interference common carp

图3 对照鱼肌纤维显微切片图Fig.3 The muscle fibers of the control fish

表1 实验鱼和对照鱼染色体的数目分布Tab.1 The chromosome numbers in the RNA interference common carp and the control common carp

图4 RNA干扰鲤肾细胞染色体中期分裂相Fig.4 Metaphase division of nephrocyte chromosome in the RNA interference common carp

图5 对照鱼肾细胞染色体中期分裂相Fig.5 Metaphase division of nephrocyte chromosome in the control common carp

由表1可知，染色体数目为100的分裂相最多，RNA干扰鲤有83个，占83%；对照鱼有82个，占82%。可确定实验鲤和普通鲤二倍体染色体的数目均为100，2n=100（图4、图5）。

2.3 染色体核型

经过测量计算得出：RNA干扰鲤染色体核型公式：2n=30m+24sm+28st+18t，染色体臂数NF=156，即有15对m染色体（中部着丝点）、12对sm染色体（亚中部着丝点）、14对st染色体（亚端部着丝点）和9对t染色体（端部着丝点）（图6）；普通鲤染色体核型公式：2n=30m+26sm+28st+16t，染色体臂数NF=156，即有15对m染色体（中部着丝点）、13对sm染色体（亚中部着丝点）、14对st染色体（亚端部着丝点）和8对t染色体（端部着丝点）（图7）。实验鲤与普通鲤染色体的大小差异不大，染色体数和臂数一致。

3 讨论

随着RNA干扰研究的进一步深入，对鱼类肌肉发育相关基因进行RNA干扰的研究已有报道。如闫学春等[7]通过显微注射技术将肌肉生长抑制基因的真核表达载体导入鲤中，促进了鲤肌肉的生长；Acosta等[14]通过注入dsRNA发现，抑制肌肉生长抑制基因都能够引起斑马鱼肌肉生长变快，促进斑马鱼的生长。应用表明，可以通过RNA干扰技术对MSTN基因进行沉默，以提高鱼类肌肉生长速度，这为获得具有特殊经济性状的基因工程鱼提供了新的技术手段。

图6 转RNA干扰鲤肾细胞核型Fig.6 Karyotype of nephrocyte chromosome in the RNA interference common carp

图7 对照鱼肾细胞核型Fig.7 Karyotype of nephrocyte chromosome in the control common carp

肌纤维类型、直径、密度、面积比例和肌节长度、结缔组织特性和肌肉脂肪含量与分布等肌肉组织学特性，是肌肉肉质的重要指标。鱼肌纤维作为肌肉的基本构成单位，肌肉纤维密度与肌肉的品质密切相关。如李池陶等[19]对大头鲤Cyprinus pellegrini、黑龙江鲤Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel、德国镜鲤 Cyprinus carpio var. specularis和杂种F3肌肉密度的比较显示，杂种F3的肌肉密度增加，大于德国镜鲤和黑龙江鲤，与大头鲤接近，表明杂种F3的肌肉品质与大头鲤相似；候粲等[23]的测定和分析结果表明：虹鳟Oncorhynchus mykiss肌肉结缔组织含量少，肌纤维密度大，口感细腻，肉质鲜美。郁二蒙等[24]对脆肉鲩与普通草鱼Ctenopharyngodon idellus背部白肌、腹部白肌和背部红肌纤维结构进行了分析，结果说明脆肉鲩肌肉的直径及密度与其肌肉硬度具有一定相关性；Johnston等[25]对大西洋鲑Salmo salar肌纤维结构的分析发现，肌纤维密度与肌肉硬度成正比，即肌肉硬度随肌纤维密度增大而增大。李西等[26]研究证明转Fst1基因可促进斑马鱼肌肉生长的同时，也进行了肌肉组织学的研究，表明在高表达卵泡抑素的转基因鱼骨骼肌中，肌纤维密度增加，但肌纤维大小变化不明显；Jannel等[14]将双链RNA显微注射到斑马鱼后，体重增长比对照组鱼高45%，肌纤维含量平均增长了48.7%。本研究中，RNA干扰鲤的肌纤维密度显著高于对照鱼，表明RNA干扰有效抑制了肌肉生长抑制素基因的表达，促进了肌纤维的增长和肌纤维密度的增加，为提升鱼类肌肉品质提供了新方法。

染色体是细胞中重要的遗传结构，往往被用作细胞遗传学分析的主要依据，但每种鱼染色体数目和结构的恒定性具有相对性，在一定的自然和人为条件下，可能发生变异[15]。本研究结果表明：RNA干扰MSTN基因鲤与正常鲤的染色体基本一致，未发现异型性染色体、随体和次缢痕，只是在染色体组型上有差异。这种染色体组型的差异，可能是染色体数目多造成测量和配组等方面的误差，至于具体原因还有待进一步研究。

综上所述，本实验RNA干扰技术沉默MSTN基因，鲤肌纤维密度产生了显著变化，特异性地抑制了肌肉生长抑制素基因的表达。染色体核型分析证明其RNA干扰基因的插入对RNA干扰鲤的染色体核型没有影响。因此，利用RNA干扰技术干扰MSTN基因的表达，对提高鱼类肌肉含量、改进肌肉的品质和促进鱼类肌肉的生长可起到重要作用。

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Muscle Fiber Density and Karyotype in RNA Interference MSTN Genne Common Carp

YAN Xue-chun,LUAN Pei-xian,HE Li-chuan,WU Xue-gong
（National Local Joint Engineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding,Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Genetic Breeding,Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

In this study,fiber density was determined in muscle and karyotype in chromosome was observed in RNA interference MSTN gene common carp（Cyprinus carpio）（referred as the RNA interference carp）and Amur River Common carp（Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel）with body weight of 116.2 g and 110.3 g by PHA and colchicine injected in vivo.The results showed that there was muscle fiber density of 163.7 ind./mm2,171.9 ind./mm2,and 162 ind./mm2in the three RNA interference carp groups,respectively,without significant difference（F=0.83,P=0.44＞0.05）,and significantly higher than that in the control group（142 ind./mm2）（F=5.24,P=0.034＜0.05）,theoretical indicating that the RNA interference carp had good muscle quality.Karyotype analysis revealed that the RNA interference carp had chromosome number of 2n=100,and karyotype formula of 2n=30m+24sm+30st+18t,NF=156.The common carp in the control group showed chromosome number of 2n=100,and karyotype formula of 2n=30m+26sm+28st+16t,NF=156.The findings indicated that the insertion of RNA interference gene has no effect on the chromosomes of common carp.

RNA interference;MSTN;muscle fiber density;chromosome karyotype

S917

A

1005-3832（2016）05-0032-05

2016-02-23

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2011AA100404）；国家水产种质资源平台项目；淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室开放课题项目（KF-2015-003）.

闫学春（1964-），男，研究员，从事分子生物学与基因工程育种研究.E-mail:yanxc8@163.com