超高效液相色谱法测定黄颡鱼肌肉中叶黄素含量

王艳，戴琴，庄晓洪

（1.成都市农业质量监测中心，成都 610045；2.成都市食品药品检验研究院，成都 610045）

超高效液相色谱法测定黄颡鱼肌肉中叶黄素含量

王艳1，戴琴2，庄晓洪2

（1.成都市农业质量监测中心，成都 610045；2.成都市食品药品检验研究院，成都 610045）

本文建立检测黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco肌肉中叶黄素含量的反相超高效液相色谱分析方法。样品经95%乙醇提取，ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm）分离，以89%甲醇-1%乙腈-10%水为流动相等度洗脱，二极管阵列检测器检测，检测波长446nm，外标法定量。结果显示：叶黄素在0.04～0.8μg· mL-1范围内线性良好，此方法检出时限0.03mg·kg-1。添加量在0.5mg·kg-1、1.0mg·kg-1、5.0mg·kg-1时，叶黄素的回收率为82.0%～84.2%，相对标准偏差在10%范围内。结果表明：该方法可用于黄颡鱼中叶黄素成分的定性和定量检测。

叶黄素；黄颡鱼；超高效液相色谱法

叶黄素是一种无维生素A活性的含氧类胡萝卜素，广泛存在于蔬菜、花卉、水果及某些藻类中。叶黄素具有抗氧化、抗衰老、抗癌等多种重要的生理活性[1]，同时具有色泽鲜艳、无毒害、安全性高、着色能力强等特点[2]，已广泛应用于食品、饲料、水产养殖等行业。叶黄素可赋予鱼类的肌肉、皮肤以卵黄色、橙色和红色，在水产养殖中已较多地使用了叶黄素类着色剂，改善养殖鱼类体色，提高其商品价值[3-5]。黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco又名黄辣丁，广泛分布于我国各大江河水系，属肉嫩味美、营养丰富的优质淡水经济鱼类，备受消费者青睐。

目前，检测叶黄素含量的方法有分光光度法[6-8]、薄层色谱法[9]、高效液相色谱法[10-12]、质谱法[13]等，多见于测定食品、饲料、植物体、奶粉、保健品及血清中叶黄素的含量，极少用于水产动物肌肉中叶黄素含量的测定。分光光度法测试的叶黄素含量是以总类胡萝卜素计，适合测试含量高的叶黄素浸膏和叶黄素粉末等原料中的叶黄素含量。正相液相色谱法以正相硅胶柱分离，非极性流动相体系洗脱，提取溶剂毒性大，操作较繁琐。质谱法虽选择性强、检测灵敏度高，但设备昂贵，检测成本高。

本研究采用95%乙醇高效快速提取黄颡鱼肌肉和皮中的叶黄素，利用超高效液相色谱检测快速的特点，建立了黄颡鱼肌肉和皮中叶黄素检测的反相超高效液相色谱新方法，此法能够满足实际检测需求。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器：ACQUITY TM超高效液相色谱仪，附二极管阵列检测器（美国Waters公司）；T25数显高速组织匀浆机（德国IKA公司）；超纯水净化仪（美国Millipore公司）。

试剂：叶黄素标准品（20mg，纯度≥95.0%，Sigma公司）；乙腈、甲醇和丙酮（HPLC级，德国Merk公司）；95%乙醇（分析纯）。

1.2 方法

1.2.1 标准品及溶液制备

准确称取叶黄素标准品5.0mg，置于50mL棕色容量瓶中，少量丙酮溶解后用甲醇定容至刻度，-20℃冰箱中避光保存。临用前，用甲醇逐级稀释成0.04μg·mL-1、0.08μg·mL-1、0.2μg·mL-1、0.4μg·mL-1、0.8μg·mL-1质量浓度的标准系列溶液。

1.2.2 超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm× 100mm，1.7μm，Waters公司）；流动相：89%甲醇-1%乙腈-10%水；流速：0.5mL·min-1；进样量：4.0μL；检测波长：446nm；柱温30℃。

1.2.3 样品处理

黄颡鱼去头、骨、内脏后取肌肉与皮组织绞碎、混匀作为试样。称取试样4.00g于50mL聚丙烯离心管中，加入 10 mL 95%乙醇，避光匀浆1min，4500r·min-1离心3min，上清液转移至25mL棕色容量瓶中。另取1个50mL离心管，加入10mL 95%乙醇，洗涤均质器刀头，用玻璃棒捣碎离心管中的沉淀，加入上述洗涤均质器刀头溶液。涡旋混合器上避光振荡5min，4500r·min-1离心3min，上清液合并至同一容量瓶中，用95%乙醇定容至25mL。取清液过0.22μm的有机滤膜即可上机。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

根据叶黄素不溶于水，易溶于油脂和脂肪性溶剂的特性，分别选取95%乙醇、丙酮-95%乙醇（50∶50，v/v）作为提取溶剂，对同一样品进行含量及回收实验，其中95%乙醇作为提取溶剂时，测定样品含量为1.64mg·kg-1，回收率为82.8%；丙酮-95%乙醇（50∶50，v/v）作为提取溶剂时，测定样品含量为1.73mg·kg-1，回收率为85.2%。测定结果表明：两种提取剂对同一样品的提取及回收率无明显差异。因此，选用对人体健康危害和环境污染更小的95%乙醇作为提取黄颡鱼中叶黄素的溶剂。

2.2 色谱柱的选择

分别选用三种规格色谱柱进行考察：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）、Kromasil 100-5 C18（4.6mm×250mm，5μm）和Agilent ZORBAX C8（4.6mm×250mm，5μm）。实验发现Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱的分析时间短、峰型效果好，具有更好的灵敏度，可与杂质峰有效分离。因此本文采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18作为分离柱。

2.3 线性关系

配制质量浓度 0.04μg·mL-1、0.08μg·mL-1、0.2μg·mL-1、0.4μg·mL-1、0.8μg·mL-1的标准系列溶液，测定色谱峰面积，以质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），得线性回归方程y=1968839x-760，r=0.9996，表明在0.04～0.8μg·mL-1范围内，叶黄素浓度与峰面积线性关系良好。根据信噪比S/N=3，得出检出限为0.03mg·kg-1。叶黄素标准曲线见图1，色谱图见图2。

图1 叶黄素标准曲线Fig.1 Standard curve of lutein

图2 色谱图（0.52mg·kg-1）Fig.2 Chromatogram（0.52mg·kg-1）

2.4 加标回收率试验

称取已知叶黄素含量的黄颡鱼试样、按照0.5mg·kg-1、1.0mg·kg-1、5.0mg·kg-1添加水平进行加标回收试验，同一添加水平重复测定6次，回收率在82.0%～84.2%范围内，各添加水平回收率的相对标准偏差RSD＜10%，满足检测要求，结果见表1。

表1 回收率Tab.1 Recoveries of the samples（n=6）

2.5 方法精密度

按照本文所述色谱条件，对试样溶液重复进样6次，其峰面积RSD为0.8%，表明该方法精密度良好。

2.6 样品测定

利用本文建立的方法分析了实验提供的22批次黄颡鱼样本，各批次样本中黄颡鱼体质量均在50～100g之间，根据鱼体色泽的差异，将样本分为灰色与黄色两组，结果各批次黄颡鱼均有叶黄素成分检出，测定结果见表2，样品色谱图见图2。

表2表明，各批次黄颡鱼中叶黄素含量水平不等，体色偏黄的黄颡鱼叶黄素含量水平明显高于体色偏灰色的样本。绝大多数水产动物自身不能合成叶黄素，其所需的叶黄素必须来源于食物或饲料，采食后吸收的色素转移到动物组织中，或转化为动物体色素表现出不同的色泽。由于叶黄素是一种广泛存在于蔬菜、花卉、水果及某些藻类生物中的天然物质，这就是为何所有的黄颡鱼均检出叶黄素的原因。但黄颡鱼养殖过程中，因养殖模式、环境不同，对天然饵料生物和人工饲料的依赖程度不同，也会使黄颡鱼体色和皮肤、肌肉组织叶黄素含量出现差异。

表2 样品测定结果Tab.2 Concentration of lutein in the muscle of Pelteobagrus fulvidraco

3 讨论

近年来随着水产动物的集约化养殖和人工配合饲料的使用，导致水产动物的色泽变淡，严重影响了水产品的质量和商品价值，于是人们开始有意识在饲料中添加着色剂来改变这种状况。农业部《饲料添加剂品种目录（2008）》（农业部公告第1126号）规定：水产动物饲料着色剂仅允许添加虾青素，《饲料添加剂品种目录（2013）》（农业部公告第2045号）新增加天然叶黄素（源自万寿菊）可作为饲料添加剂中的着色剂用于水产养殖动物。尽管农业部不断更新《饲料添加剂品种目录》，但对各类色素的使用剂量未予明确限定，也没有水产动物检测的国家或地方标准，这无疑导致一些着色剂的使用存在较大的安全隐患。本文建立的黄颡鱼中叶黄素含量测定的高效液相色谱法前处理简单，色谱条件易于实现，测试数据重复性好，精密度和准确度均能满足理化分析要求，适用于黄颡鱼中叶黄素含量的日常检测，同时也为相关水产动物中叶黄素检测提供了参考。

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［3］韩秀萍,张绪元.叶黄素着色研究进展［J］.安徽农业科技,2009,37（6）:2343-2344.

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Determination of Lutein in Muscle of Pelteobagrus fulvidraco by Ultra Performance Liquid Chromatography

WANG Yan1,DAI Qin2,ZHUANG Xiao-hong2
（1.Agriculture Quality Supervision and Test Center of Chengdu City,Chengdu 610045,China; 2.Chengdu Institute for Food and Drug Control,Chengdu 610045,China）

A reversed-phase ultra-performance liquid chromatography method was established for the determination of lutein in muscle of Pelteobagrus fulvidraco．The sample was extracted by 95%alcohol.Chromatographic separation was performed at the conditions of ACQUITY UPLC BEH C18column（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）and 89%methcol-1%acetonitrile-10%water as the mobile phase with isocratic elution．It was detected on a photodiode array detector at the wavelength of 446 nm and quantified by external standard method.The results showed that the method had a good linear correlation within the range from 0.04 μg·mL-1to 0.8 μg·mL-1,and the detection limit was 0.03 mg·kg-1．The average recoveries of lutein varied from 82.0%to 84.2%spiked at 0.5 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、5.0 mg·kg-1with relative standard deviations less than 10%.This developed method is expeditious and reliable,especially feasible for quantitative and qualitative analysis of lutein in Pelteobagrus fulvidraco．

lutein；Pelteobagrus fulvidraco；ultra-performance liquid chromatography method

S965.199

A

1005-3832（2016）06-0052-04

2016-07-15

王艳（1978-），女，高级农艺师.E-mail:46274001@qq.com