虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗工程菌发酵工艺研究

赵景壮，徐黎明，刘淼，曹永生，刘红柏，尹家胜，卢彤岩

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗工程菌发酵工艺研究

赵景壮，徐黎明，刘淼，曹永生，刘红柏，尹家胜，卢彤岩

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

急性传染性造血器官坏死病（infectious hematopoietic necrosis，IHN）严重威胁虹鳟Oncorhynchus mykiss养殖业，造成严重的经济损失，核酸疫苗已成为虹鳟IHN疾病预防的研究热点。本研究首先检测虹鳟IHN核酸疫苗工程菌的遗传稳定性，结果显示工程菌在连续培养30代后，仍能保持稳定的质粒拷贝数。质粒酶切结果表明：连续培养30代后的质粒依然保持良好的完整性。在筛选高拷贝工程菌的基础上，又研究核酸疫苗的高密度发酵培养基、补料及发酵时间。结果表明：最优的发酵培养基配方为：1.2%胰蛋白胨（Tryptone）、2.4%酵母提取物（Yeast Extract）、0.5%甘油、0.017 mol·L-1KH2PO4、0.072 mol·L-1K2HPO4；补料配方为：3%胰蛋白胨、1.5%酵母提取物、50%甘油，最佳发酵时间为16h。本研究可为虹鳟IHN核酸疫苗的规模化生产提供参考。

虹鳟；传染性造血器官坏死病；核酸疫苗；发酵

传染性造血器官坏死病（infectious hematopoietic necrosis，IHN）是一种严重威胁鲑鳟的急性传染病[1-3]。它主要感染鱼类的脾脏和肾脏等造血组织，引起组织坏死[4]，根据鱼种、鱼龄、病毒菌株及饲养环境的不同，死亡率在80%～100%[5,6]。近年来IHN在我国频繁暴发，使我国的鲑养殖业经济损失严重[7-10]。IHN的病原为传染性造血器官坏死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV），其表面糖蛋白（glycoprotein，G）是病毒表面的主要抗原，与病毒的毒力强弱直接相关，目前多将其基因作为疫苗研制的主要基因[11-13]。

核酸疫苗又称基因疫苗，是近年来新兴的研究领域，主要分为DNA疫苗和RNA疫苗。它主要是将编码抗原蛋白的基因克隆到真核表达载体上，然后通过注射将重组质粒带入动物细胞，利用宿主细胞的转录系统合成外源抗原蛋白，激活机体免疫反应[14]。目前在预防虹鳟IHN疾病的研究中，已广泛应用DNA核酸疫苗[5,15,16]。

为了能够获得高产量的虹鳟传染性造血器官坏死病DNA核酸疫苗，本研究在筛选高拷贝工程菌的基础上，通过研究DNA疫苗的高密度发酵条件，以期为虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗的规模化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 高拷贝工程菌株的筛选

将本实验室保存的DH5α/pcDNA3.1-G工程菌在含有100μg·mL-1氨苄青霉素（Amp+）的LB固体培养基上划线，37℃倒置培养12h后，挑取单菌落于含有100μg·mL-1Amp+的液体培养基中，置于摇床中37℃180r·min-1振荡培养。当菌体的OD600达到0.4～0.6时，12 000r·min-1离心收集菌体，抽提工程菌株细胞内的质粒，并选择质粒提取含量最高的菌株作为发酵用种子，进行工程菌的甘油保种并保存于-80℃。

1.3 工程菌质粒稳定性检测

将本研究中筛选所得的高拷贝工程菌株按1%比例接种于含有100μg·mL-1Amp+的LB液体培养基中，37℃180r·min-1振荡培养12h后再次按1%比例接种到含有同浓度Amp+的LB液体培养基中进行传代培养，重复上述传代操作30次。每次传代前留取样品，检测质粒稳定性。

1.4 发酵培养基的筛选

本研究设计4种发酵用培养基，培养基A：1% Tryptone、0.5%Yeast Extract、1%NaCl；培养基 B：1.6%Tryptone、1%Yeast Extract、0.5%NaCl；培养基C：1.2%Tryptone、2.4%Yeast Extract、0.5%甘油（glycerol）、0.017mol·L-1KH2PO4、0.072 mol·L-1K2HPO4；培养基D：0.5%Tryptone、1.5%Yeast Extract、1%葡萄糖（glucose）、0.009mol·L-1KH2PO4、0.25mol·L-1K2HPO4。以上4种培养基灭菌后均加入微量元素贮存液，终浓度为 1mL·L-1。微量元素贮存液配方如下：0.01mol·L-1FeSO4·7H2O、0.01mol·L-1MnCl2·4H2O、0.01mol·L-1CoSO4·7H2O、0.01mol·L-1CaCl2、0.006mol· L-1CuCl2·2H2O、0.004mol·L-1ZnSO4·7H2O。发酵结束后分别检测菌体OD600、菌体湿重、质粒含量，筛选出最佳发酵培养基。

1.5 发酵补料的筛选

本实验通过单因素实验、Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和响应面优化发酵法确定了百香果酸奶最佳发酵工艺。结果表明：以果汁添加量、白砂糖添加量和发酵温度为自变量，响应面法优化得出百香果酸奶的最佳发酵工艺为白糖添加量7.4%，接种量0.1%，百香果果汁添加量5.5%，发酵温度42.7℃，发酵时间5 h。在此条件下，酸奶感官评分约达到94.33分，与预测值（93.9705分）基本相符，此结果可充分验证该试验模型的可靠性。实验检测出百香果酸奶的酸度为73°T，乳酸菌检测数为5.8×108 mL-1，大肠杆菌没有检测出。本实验研制的百香果酸奶的品质完全符合国家发酵乳的标准[15]。

本研究共设计3种补料，补料Ⅰ：3%Tryptone、1.5%Yeast Extract、50%glycerol；补料Ⅱ：3%Tryptone、1.5%Yeast Extract、50%glucose；补料Ⅲ：5% Tryptone、3%Yeast Extract。发酵结束后分别检测菌体OD600、菌体湿重、质粒含量，筛选出最佳补料配方。

1.6 发酵培养参数

取-80℃冻存的菌种接种于LB液体培养基中，37℃180r·min-1振荡培养10h后，按1%的比例转接到新的LB液体培养基中。待振荡培养10h后，按1%的比例接种于10L发酵罐内（培养基体积为7L）进行发酵培养。温度设定为37℃，转速250r·min-1，罐压控制在0.01 Mpa左右，pH用氨水和磷酸自动调至（7.0±0.1）。发酵过程中，溶氧控制在30%以上，前期溶氧低于30%时采用提高搅拌转速增加溶氧，每次转速提高50r·min-1；当搅拌桨转速达到最大值时（700r·min-1），采用补料添加速率控制溶氧，当罐体内溶氧高于或低于30%时，分别加快或减慢补料添加速度，发酵时间为18h。发酵过程中每1h取少量发酵液检测菌体OD600、菌体湿重、质粒含量，确定最佳发酵时间。

2 结果与分析

2.1 高拷贝工程菌的遗传稳定性

工程菌经连续传代培养后，质粒DNApcDNA3. 1-G在大肠杆菌DH5α中能够保持稳定的质粒拷贝数（图1）；经过30代的传代培养后对质粒进行酶切。结果显示：在1 725bp处出现特异性条带，表明质粒依然保持了完整性（图2），即DH5α/pcDNA3. 1-G可以作为发酵所用的工程菌。

图1 连续传代30次质粒稳定性检测Fig.1 Plasmid stability in 30 consecutive batches

图2 传代30次后质粒酶切检测Fig.2 Identification of plasmid in 30 consecutive batches by dual-digestion

2.2 发酵培养基的筛选结果

将遗传稳定的高拷贝工程菌DH5α/pcDNA3. 1-G菌株分别接种到4种体积均为500mL的发酵筛选培养基中，37℃180r·min-1振荡培养12h后分别收集发酵菌体，抽提质粒。发酵结果表明，经过12h的摇瓶发酵后，培养基C的配方更加适合工程菌株的高密度生长及高产量质粒的复制。

2.3 补料的成分

3种补料配方的发酵结果表明，添加了3种补料后工程菌的菌体量明显提高，其中添加补料Ⅰ后菌体量及单位工程菌的质粒含量都明显优于其他2种补料。

表1 不同培养基对菌体密度和质粒产量的影响Tab.1 Effect of different media on the cell density of and plasmid DNA yield in the bacterial strain

表2 不同补料组成对菌体密度和质粒产量的影响Tab.2 Effect of ingredients of feed medium on the cell densityandplasmidDNAyieldinthebacterialstrain

2.4 发酵时间的影响

发酵过程中每1h取少量发酵液检测菌体OD600及质粒含量,结果表明：随着工程菌的发酵培养，质粒的含量也逐渐增加，当发酵16h时单位工程菌的质粒含量达到最高值，此后，虽然工程菌的OD600和质粒含量都仍有增加，但是单位工程菌的质粒含量却下降，因此16h为最佳的发酵培养时间。

图3 不同培养时间对质粒发酵结果的影响Fig.3 Influence of culture period on fermentation product

3 讨论

核酸疫苗具有构建简单、免疫效果好、保护期长、生产成本低、使用安全等优点，而被广泛应用于鱼类疾病的免疫预防中[14]。生产核酸疫苗的成本是限制其应用的主要瓶颈之一，能否用低成本获得高产量的核酸疫苗也是疫苗生产的关键技术[17]。

传统的发酵工艺利用细菌高密度发酵获得重组蛋白，而目前的核酸疫苗发酵工艺普遍采用补料-分批发酵的方式进行。当发酵过程中培养基的营养成分不足时，采用流加补料的方式提高菌体生长密度以及核酸的表达量[18-20]。核酸的发酵生产不同于常规的高密度培养，获得高密度的生物产量不一定能够获得高的质粒产量。在核酸的发酵过程中要考虑到核酸的容积比（mg/L），只有获得了相对较高的核酸容积比才能够降低发酵核酸疫苗的成本。因此摸索、优化核酸发酵条件是核酸疫苗生产中不可忽略的重要因素。

菌体核酸的稳定性直接影响到最终核酸疫苗的表达量，在高密度发酵扩增菌体时核酸容易丢失[21]。本研究在优化DH5α/pcDNA3.1-G的发酵工艺前，建立了稳定的发酵工程菌株，并检测了其遗传的稳定性。结果表明：连续传代30次后，工程菌仍然有稳定的遗传性，能够用于建立大规模发酵过程中的种子库。本研究选择了4种大肠杆菌常用的培养基，并对其改良后进行了发酵筛选。结果表明，培养基C的配方更适合DH5α/pcDNA3.1-G菌株的高密度发酵。培养基C和D含有的碳及氮源量高于培养基A、B，其中的磷酸盐缓冲性对稳定发酵过程中的pH起到了一定的缓冲作用。培养基C比D更加适用于核酸疫苗的发酵，可能是其利用甘油替代葡萄糖的缘故。在发酵的过程中，当菌体的比生长速率超过了一定值后会产生大量的乙酸，而大肠杆菌能够直接利用葡萄糖而产生大量的乙酸，抑制细菌的生长和质粒的复制，并且菌体比生长速率太快不利于质粒的大量复制[22-24]。利用甘油代替葡萄糖，不但能够降低发酵过程中乙酸的产量，还能降低大肠杆菌的比生长速率，获得较高的菌体生物量及质粒产量[22]。

本研究对发酵中补料的筛选结果表明，添加补料Ⅰ后，菌体量及单位工程菌的核酸含量都明显优于其他2种补料。Danquah等[25]的研究也表明，采用甘油为碳源进行的补料培养中，核酸的产量明显提高。这可能是由于本研究采用甘油为补料中主要碳源，并以恒速流加的补料方式更加符合菌株及目的产物的生产特性。本研究中对发酵时间的摸索表明，发酵2～4h后质粒复制速率升高，16h时单位菌体的质粒含量达到峰值；随后，虽然菌体的OD600有缓慢的升高，但是单位菌体的质粒含量反而下降，说明在菌体的生长进入对数生长后期时，质粒出现了部分丢失，这可能是由于培养基的养分消耗殆尽，影响了菌体的遗传稳定性。因此发酵16h后结束发酵，不但可以获得高产量的质粒，还能减低发酵的生产成本。

本研究对虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗的发酵工艺进行了初步研究。结果表明：培养基C：1.2%Tryptone、2.4%Yeast Extract、0.5%glycerol、0.017mol·L-1KH2PO4、0.072mol·L-1K2HPO4；补料Ⅰ：3%Tryptone、1.5%Yeast Extract、50%glycerol更加适合虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗的发酵；发酵16h能够获得高产量的核酸疫苗。

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Engineering Bacterial Fermentation of DNA Vaccine Against Rainbow Trout Infectious Hematopoietic Necrosis

ZHAO Jing-zhuang,XU Li-ming,LIU Miao,CAO Yong-sheng,LIU Hong-bai,YIN Jia-sheng,LU Tong-yan
（Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

Infectious hematopoietic necrosis（IHN）,as one of the most serious disease causing acute,systemic and virulent disease in rainbow trout Oncorhynchus mykiss,often results in serious economic losses in rainbow trout industry.The DNA vaccine against IHN has been widely studied to make the efficient protection.The genetic stability of engineering bacteria was first studied and the engineering bacterium with high copy was screened in order to obtain high yield of IHN DNA vaccine.The results showed that the engineering bacteria maintained stable plasmid copy number in thirty-generation succession culture,and the plasmid remained good integrity according to enzyme digestion.The optimal medium for fermentation was screened in the medium of 2%Tryptone,2.4%Yeast Extract,0.5%glycerol,0.017 mol·L-1KH2PO4and 0.072 mol·L-1K2HPO4.It was found that the optimal feeding was comprised of 3% Tryptone,1.5%Yeast Extract,50%glycerol during the culture time of 16 h.The optimal condition for IHN DNA vaccine fermentation provides a reference for the large-scale production of rainbow trout IHN DNA vaccine.

rainbow trout;infectious hematopoietic necrosis virus;DNA vaccine;fermentation

Q785；S917

A

1005-3832（2016）06-0014-05

2016-09-20

国家科技支撑计划（2012BAD25B02）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（HSY201410）；黑龙江省冷水性鱼类种质资源及增养殖重点开放实验室(201104).

赵景壮（1987-），男，助理研究员.E-mail:zhaojingzhuang1987@163.com

卢彤岩（1967-），女，研究员.E-mail:lutongyan@hrfri.ac.cn