大肠杆菌O抗原定型血清标定用抗原的制备

张媛，王秀丽，刘博，张磊，李建，彭国瑞，辛凌翔，蒋玉文

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

大肠杆菌O抗原定型血清标定用抗原的制备

张媛，王秀丽，刘博，张磊，李建，彭国瑞，辛凌翔，蒋玉文*

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

为研制用于标定大肠杆菌菌体抗原(O抗原)单因子定型血清效价的抗原，以大肠杆菌参考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)为菌种，经条件优化确定了抗原制备的工艺。检测结果表明，当菌液调整至OD600 nm值为0.147±0.026时，各型抗原的浓度为1×109CFU/mL,将其热处理后制备成反应抗原。按此吸光值各自制备3批抗原，3批抗原与血清的凝集价均分别一致，分别达到211(O2)、212(O7)及29(O74)。用180种大肠杆菌O抗原单因子定型血清对制备的抗原进行检测，制备的抗原仅与其对应型的血清发生特异性反应，与其余179种血清均不发生反应。研究结果显示，制备的抗原具有较好的稳定性及特异性，可以用于大肠杆菌菌体单因子定型血清效价的标定。

大肠杆菌；菌体抗原；单因子血清

大肠杆菌菌体抗原(O抗原)是大肠杆菌的脂多糖分子的一部分，是菌株血清分型的主要依据。大肠杆菌的O抗原型非常多，至今已发现180种之多。研究资料表明，常引起猪大肠杆菌病的血清型有O1、O2、O3、O6、O8、O9、O11、O14、O15、O17、O18、O20、O22、O23、O24、O26、O32、O35、O38、O44、O45、O48、O51、O52、O53、O54、O55、O60、O64、O65、O78、O89，O91、O93、O97、O98、O101、O102、O104、O107、O115、O118、O119，O125、O126、O132、O137、O138、O139、O141、O147、O149、O152、O153、O156、O157、O159、O163等[1～5]。鸡大肠杆菌病通常是由O1、O2、O78三种血清型的大肠杆菌所引起，此外也有研究学者从发病鸡病料中分离到血清型为O3、O4、O8、O9、O11、O15、O18、O20、O22、O26、O30、O35、O36、O38、O50、O60、O75、O76、O81、O88、O89、O93、O103、O111、O114、O115、O127、O128、O131、O133、O143、O149、O152、O159、O161的大肠杆菌[6～8]。鸭致病性大肠杆菌的血清型以O76、O78、O92、O142最为常见[9]。奶牛致病性大肠杆菌血清型中以O6、O10、O17、O21、O51、O53、O60、O77、O92、O101、O125、O148、O158较为普遍[10～11]。犬、猫、鸽子等宠物致病性大肠杆菌的优势血清型是O10、O24、O64、O119、O137、O147、O149、O157等[12]。

血清学方法是鉴定大肠杆菌O抗原型的经典方法。一株大肠杆菌只具有单一O抗原型，但是，现今国内相关血清产品由于生产工艺粗糙，往往鉴定不出菌株的单一血清型。本课题组拟改进大肠杆菌O抗原定型血清生产工艺，制备出特异性良好的单因子定型血清，在制备过程中需要使用反应抗原对血清进行类属凝集素的筛查，并对血清进行效价标定，这就需要反应抗原自身的质量稳定，达到不同批次抗原与同一血清的凝集程度一致。本研究利用大肠杆菌参考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)进行可用于标定大肠杆菌菌体单因子定型血清效价的抗原的制备。

1 材料与方法

1.1 材料1.1.1 菌株 大肠杆菌CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)，由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供。

1.1.2 培养基 普通肉汤、普通琼脂，购自北京中海动物保健科技公司。

1.1.3 试剂 大肠杆菌O抗原定型血清，由中国兽医药品监察所细菌制品检测室提供。大肠杆菌O抗原单因子定型血清，购自丹麦国家血清研究院(SSI)。

1.1.4 主要仪器设备 GNP-9270型隔水式恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司。THZ-C型恒温振荡器购自太仓市实验设备厂。Herasafe KS生物安全柜购自德国Heraeus公司。酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法 本试验开展了用于制备大肠杆菌菌体抗原的细菌最适增值条件、抗原浓度的确定、菌液吸光值的测定、热处理方式的优化、保存期试验等研究，明确了抗原制备工艺，并检查了抗原特异性，具体试验方法如下：

1.2.1 制备抗原用菌液最适增殖条件的确定 将大肠杆菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株冻干菌种接种普通肉汤培养基复壮后，划线接种普通琼脂培养基平板，37 ℃培养16、20、24 h后，分别挑取单菌落接种100 mL普通肉汤培养基，37 ℃静置及37 ℃ 200 r/min振荡分别培养6 h及24 h。通过活菌计数[13]测定各组菌液浓度。

1.2.2 抗原浓度的确定 按上述确定的细菌生长条件制备大肠杆菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株菌液，将菌液分别调整为6×109CFU/mL、4×109CFU/mL、2×109CFU/mL、1×109CFU/mL、5×108CFU/mL、3×108CFU/mL、1×108CFU/mL、6×107CFU/mL 8个浓度后，经121 ℃高压2 h后制备成反应抗原。将由中国兽医药品监察所细菌制品检测室提供的与3种抗原相对应的O2、O7、O74大肠杆菌O抗原定型血清分别进行对倍系列稀释至212。将不同浓度抗原与相应的不同稀释度血清进行棋盘反应，以与最高稀释倍数血清发生凝集的抗原浓度为最适抗原浓度。

1.2.3 菌液吸光值的测定 按上述确定的细菌生长条件制备大肠杆菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株菌液，将菌液分别进行2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀释后，分别测定不同稀释度菌液OD600nm值，并计算菌液浓度。以菌液浓度的对数值为横坐标，以OD600nm值为纵坐标，分别计算线性回归方程，并通过方程确定最适抗原浓度所对应的吸光值范围。

1.2.4 菌液热处理方式的优化 按上述确定的细菌生长条件制备大肠杆菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株菌液，用生理盐水将其调整到OD600nm值在最适抗原浓度所对应的吸光值范围内，分别采用沸水浴及121 ℃高压30、60、90、120 min的方式进行热处理。通过微量凝集试验用大肠杆菌O抗原定型血清测定各组抗原效价。

1.2.5 抗原生产工艺的制定 将上述最适细菌增殖条件、菌液浓度调整及热处理方式进行汇总，制定出大肠杆菌O抗原制备工艺。

1.2.6 抗原质量评价 每株菌均制备3批菌液，将菌液浓度调整到OD600nm值在最适抗原浓度所对应的吸光值范围内，计算菌液浓度，然后经最优方式热处理后制备成反应抗原。对制备好的血清型分别为O2、O7、O74的大肠杆菌抗原，用丹麦国家血清研究院(SSI)生产的单因子定型血清进行特异性检查，并测定各批抗原的凝集价。

1.2.7 抗原保存期试验 抗原等量分装后置2～8 ℃保存，每个月取出1瓶进行性状、无菌检验、效价测定及均一性检查。

2 结果与分析

2.1 细菌增殖条件优化 CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414三株菌均为划线接种平板37 ℃培养20 h后,取单菌落接种普通肉汤培养基37 ℃ 200 r/min振荡培养24 h后菌液浓度最高(表1)。

表1 大肠杆菌不同培养条件菌液浓度测定(单位：CFU/mL)

注：加下划线为各菌株菌液浓度的最高值

2.2 抗原浓度的确定 CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414三株菌制备的反应抗原浓度均为1×109CFU/mL时与对应血清发生凝集的凝集价最高(表2、表3、表4)。

表2 CVCC1345大肠杆菌抗原与不同稀释度O2血清凝集价测定

注：“+”表示凝集，“-”表示不凝集，加下划线为与血清凝集价最高的抗原浓度

表3 CVCC1350大肠杆菌抗原与不同稀释度O7血清凝集价测定

注：“+”表示凝集，“-”表示不凝集，加下划线为与血清凝集价最高的抗原浓度

表4 CVCC1414大肠杆菌抗原与不同稀释度O74血清凝集价测定

注：“+”表示凝集，“-”表示不凝集，加下划线为与血清凝集价最高的抗原浓度

2.3 菌液吸光值测定结果 将3种菌液均进行2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀释，测定菌液浓度与吸光值的线性回归方程(表5)。通过线性回归方程计算出抗原型分别为O2、O7、O74的大肠杆菌菌液，浓度为1×109CFU/mL时所对应的OD600nm值分别为0.125、0.184、0.132，平均值为0.147，标准差为0.026，由此可知，培养后的菌液调整至OD600nm值在0.147±0.026范围内，菌液浓度约为1×109CFU/mL。

表5 大肠杆菌菌液浓度与吸光值的线性回归方程

注："x"表示菌液浓度的对数值，"y"表示菌液OD600nm值

2.4 菌液热处理方式的确定 大肠杆菌菌液通过热处理破坏荚膜抗原(K抗原)，使O抗原暴露与O血清发生凝集。不同菌株培养菌液采用121 ℃高压60 min的热处理方式，抗原凝集价均可达到最大值(表6)。

表6 大肠杆菌菌液不同热处理方式及时间制备的抗原效价测定

注：加下划线为各抗原凝集价的最高值

2.5 抗原制备工艺 菌株复壮后，划线接种普通琼脂平皿，37 ℃培养20 h后，取单菌落接种普通肉汤100 mL，37 ℃ 200 r/min培养24 h后，用普通肉汤将其稀释至OD600nm值为0.147±0.026，121 ℃高压1 h，待其恢复室温后，按0.1%加入甲醛溶液，定量分装，置2～8 ℃保存备用。

2.6 抗原质量评价结果 不同菌株3次制备的菌液稀释至OD600nm值为0.147±0.026时，菌液浓度均为1×109CFU/mL，各抗原仅与其相对应的血清发生凝集反应，与其他型血清均不反应，说明抗原特异性良好，抗原凝集价分别相同(表7)。

表7 不同批次抗原吸光值及凝集价

2.7 抗原保存期试验结果 抗原置2～8 ℃至少可保存13个月(表8)。

表8 不同保存时间抗原的质量评价

3 讨论与小结

大肠杆菌病是一类重要的人畜共患病，多项关于致病性大肠杆菌检测的国家标准及行业标准中都要求对其O抗原进行血清学凝集试验，以确定其O抗原型[14-15]。目前已知的大肠杆菌O抗原型有180种，制备大肠杆菌O抗原定型单因子血清的基础就是要先制备出该180种反应抗原，且要求对抗原浓度予以确定，从而保证不同批次抗原与同一批次血清的凝集结果相一致，进而保障不同批次血清效价的一致性。本课题组通过试验明确了最适抗原浓度为1×109CFU/mL，要把抗原固定在此浓度虽可采用活菌计数的方法直接确定菌液浓度，但由于要制备180种抗原，若逐一进行活菌计数，工作量巨大，不适用生产化，故未采用。本研究采用了测定菌液浊度的方法确定菌液浓度，由于与标准比浊管比浊的方法人为判断误差较大，故没有采用，而是选用了测定菌液吸光值的方法。通过探寻吸光值与菌液浓度间的平行关系，最终确定将培养后的菌液稀释至OD600nm值为0.147±0.026时，菌液浓度约为1×109CFU/mL。为了验证此吸光值范围确定的是否准确，制备了O2、O7、O74三种抗原各3批，分别将浓度调整到OD600nm值为0.147±0.026时与各自对应血清进行凝集反应，结果显示各血清型3批抗原的凝集价分别一致，说明通过测定菌液OD600nm值可以固定抗原浓度。

在以往大肠杆菌O抗原制备过程中采用121 ℃高压2 h的方式进行热处理，丹麦国家血清研究院(SSI)推荐的大部分抗原的热处理方式是沸水浴1 h，但对个别抗原仍推荐高压的方式。本课题组比较了沸水浴及121 ℃高压分别热处理30、60、90、120 min对抗原凝集价的影响，结果表明不同菌株培养菌液采用121 ℃高压1 h的热处理方式抗原凝集价均可达到最大值。

本课题组明确了抗原制备工艺，为继而制备180种反应抗原奠定了基础,且制备的抗原各项指标经检测均合格，无菌、特异、均一、稳定，可以用于大肠杆菌菌体单因子定型血清效价的标定。抗原在2～8 ℃条件下至少可保存13个月。

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[14]GB/T 4789.6-2003. 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验[S].

[15]WS/T 8-1996. 病原性大肠艾希氏菌食物中毒诊断标准及处理原则[S].

(编辑：侯向辉)

The Preparation ofE.coli’s Antigen which Calibrate the Titer of the Mono-Factor Stereotype Serum

ZHANG Yuan, WANG Xiu-li, LIU Bo, ZHANG Lei, LI Jian，PENG Guo-rui, XIN Ling-xiang, JIANG Yu-wen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugsControl，Beijing100081，China)

In order to develop antigen that can be used to calibrate the titer ofE.colibacteria’s single factor stereotype serum. In this study theE.coli

train CVCC1345 (O2), CVCC1350 (O7), CVCC1414 (O74) as a species, is determined by the conditions to optimize their production processes. Our test results showed that the bacteria which will be prepared as the antigen after the heat treatment adjusted to OD600nmvalue of 0.147±0.026, the concentration of 1× 109CFU/mL. According to this absorbance value of each antigen, we have 3 batches of the prepared antigen. Three batches of antigen and serum agglutination titer are consistent respectively which reached 211(O2), 212(O7) and 29(O74). We tested the prepared antigen with 180 kinds of mono-factor stereotype serum ofE.coli, only the prepared antigen of the corresponding type of serum could react specifically, the rest of the 179 kinds of serum not react. The results showed that the prepared antigen having better stability and specificity ofE.colibacteria can be used to calibrate the titer of the mono-factor stereotype serum.

Escherichiacoli; bacterial antigen; mono -factor stereotype serum

张媛,副研究员，从事需氧菌类生物制品检测研究。

2016-08-09

A

1002-1280 (2016) 12-0012-07

S852.61