异氟烷对心肌细胞血管内皮生长因子表达的影响

刘志刚 刘永芳 罗涛 陈雪君 夏中元 陈向东

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是临床上各种疾病、休克、创伤及体外循环心血管手术等病理过程中常见的损伤，由多种细胞内信号途径参与并介导。研究发现，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与心肌缺血再灌注损伤具有密切关系，对缺血心肌具有保护效应[1]。吸入麻醉药预适应可通过调节某些离子通道的开放以及促进某些蛋白激酶的活化而对心肌细胞起保护作用。其中蛋白激酶C(PKC)家族是介导预适应保护作用的重要途径，机制尚不明确。本实验通过观察临床麻醉常用吸入性麻醉药异氟烷对培养大鼠心肌细胞VEGF分泌及PKC蛋白表达的影响，探讨异氟烷心肌保护的分子机制。

材料与方法

1.主要试剂与药品：PKC抑制剂Calphostin C(Sigma，美国)，5′-溴脱氧尿苷(Sigma，美国)，异氟烷(Abbott，美国)，高糖 DMEM培养基(Hyclone，美国)，胎牛血清(Hyclone，美国)，兔抗鼠 PKCα、PKCδ、PKCζ和 PKCε抗体(Santa Cruz，美国)，羊抗兔 IgG(Santa Cruz，美国)，VEGF酶联免疫试剂盒(R＆D Systems，美国)，其他试剂均为Sigma公司产品。

2.心肌细胞分离培养：取1～3d SD新生大鼠，雌雄不拘，参照既往文献方法略作改良分离培养心肌细胞[2]。无菌条件下开胸取出心室肌，清洗后加入0.05％胶原酶、0.08％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液，分次消化、离心，以15％胎牛血清的高糖DMEM悬浮细胞，差速贴壁法去除成纤维细胞。收集心肌细胞将浓度调整为5×105cells/ml之后均匀接种，置CO2培养箱(5％CO2，37℃)中培养。培养的前2d加入5-溴脱氧嘧啶0.1mmol/L，抑制非心肌细胞贴壁生长。

3.实验分组：心肌细胞随机分为：对照组，细胞不经任何处理；异氟烷组，将细胞培养皿置入一设有通气及出气接口的自制小无菌密闭容器，保持37℃恒温，容器进气端与麻醉机相连，持续输入经气体监护仪校正的异氟烷，以维持容器内异氟烷浓度分别为0.5、1、1.5MAC(95％O2＋5％CO2)6h后关闭异氟烷；PKC抑制剂组，PKC抑制剂calphostin C加入细胞培养液中使其终浓度为50nM，PKC抑制剂＋异氟烷组，心肌细胞培养液中加入calphostin C 50nM，经1.0MAC异氟烷共同作用6h[3]。

4.指标测定：培养液VEGF：收集细胞培养液经1500 rpmin离心5min，取上清成分，采用ELISA方法检测VEGF的含量。根据试剂盒要求依次加样、孵育、洗涤、显色，最后在酶标仪450nm波长测定样品吸光度值。每份样本设2个复孔。以光吸收值为纵坐标，标准品浓度(pg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，求出标准方程。通过标本的吸光度值得出培养上清液中的VEGF浓度。

5.统计学处理：采用Prism统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.异氟烷浓度依赖性增加心肌细胞VEGF分泌：与0MAC组比，1MAC和1.5MAC组VEGF值均显著升高(P＜0.01)，与0.5MAC组比，1MAC和1.5 MAC组VEGF值亦显著升高(P＜0.05)，与1MAC组，1.5MAC组 VEGF升高(P＜0.05)(表1)。

2.PKC抑制剂抑制异氟烷诱导的VEGF分泌：经1MAC异氟烷作用6h后，与CON组比，ISO组VEGF值显著升高(P＜0.01)，经 PKC抑制剂calphostin C处理后，VEGF含量显著降低，明显低于异氟烷组(P＜0.01)，CAL组和CON组比较差异无统计学意义(P＞0.05)(表2)。

表1 不同浓度异氟烷作用下心肌细胞VEGF含量的比较(pg/ml，±s)

表1 不同浓度异氟烷作用下心肌细胞VEGF含量的比较(pg/ml，±s)

注：与0MAC组比，aP＜0.01；与0.5MAC组比，bP＜0.05；与1.0MAC组比，cP＜0.05

指标0MAC 0.5MAC 1MAC 1.5MAC VEGF 63.83±8.159 74.67±10.01 100.80±13.83ab 126.80±17.78abc

讨 论

心肌缺血再灌注损伤是临床常见病理现象。心肌血管生成是损伤心肌修复的重要机制之一，梗死区内是否有血管迅速生成，对于心肌梗死后建立良好的侧支循环以改善梗死区血液供应及梗死区心肌的存活均密切相关。因此，及时采取有效干预措施来促进缺血区的新血管生成，对心肌缺血再灌注损伤后心功能的恢复具有非常重要意义。

VEGF是迄今发现的特异性最高、活性最强的血管生长因子，可促进内皮祖细胞的增殖、迁移和趋化。在正常情况下，心肌细胞内的VEGF含量很少，用一般的检测方法很难发现，当冠状动脉狭窄或梗塞导致心肌缺血缺氧时，可刺激局部心肌迅速表达VEGF基因及其蛋白[4]。VEGF表达受细胞内蛋白激酶系统(如酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C)及转录水平(缺氧诱导因子-1、激活蛋白-1)等多个不同环节的调控[5]。本研究结果表明，心肌细胞分别经0.5 MAC、1MAC和1.5MAC异氟烷作用6h后，与0MAC组比较，VEGF值显著升高，且随着异氟烷浓度的增高VEGF释放亦增加，说明异氟烷浓度依赖性增加心肌细胞 VEGF释放。PKC特异性抑制剂Calphostin C对心肌细胞VEGF分泌无显著影响，但Calphostin C预处理显著降低了异氟烷诱导的VEGF释放，表明异氟烷诱导的心肌细胞VEGF产生与PKC途径激活有关。

表2 各组心肌细胞VEGF含量的比较(pg/ml，±s)

表2 各组心肌细胞VEGF含量的比较(pg/ml，±s)

注：与 CON组比，aP＜0.01；与 CAL组比，bP＜0.01；与 IC组比，cP＜0.01

指标 CON组 ISO组 CAL组 IC组VEGF 62.67±6.713 101±13.27abc 64.67±10.78 76.00±7.43

PKC存在于多种组织中，是一种由钙离子激活的磷脂依赖性蛋白激酶，是细胞内信号传导的重要递质。近年已有报道异氟烷预处理可激活心肌细胞PKC，但结果尚存在争议。Uecker研究发现异氟烷预处理可诱导PKCδserine643磷酸化，激活转位至线粒体并开放线粒体ATP依赖的钾通道从而减轻心肌缺血再灌注损伤[6]；与之相对的是Pravdic研究发现异氟烷预处理激活PKCε而非PKCδ亚型[7]；Ludwig则认为PKCδ和PKCε激活共同参与了异氟烷的心肌保护机制[8]。上述报道的差异可能源于不同的实验模型如在体或离体实验，以及异氟烷不同的作用时间或窗口等。本研究采用新生大鼠心肌细胞为研究对象，首次证实临床相关浓度异氟烷诱导心肌细胞释放VEGF。实验中应用PKC抑制剂Calphostin C不具有亚型特异性，但并不影响我们的推论PKC参与了异氟烷诱导VEGF释放的效应。目前尚无对PKC亚型具有特异性阻断作用药理工具药，后续实验有待使用PKC亚型特异性肽抑制剂或分子生物学方法，并通过整体动物实验进一步深入探讨这一发现。

目前关于麻醉药心血管保护作用的研究，主要限于麻醉药对心肌缺血再灌注损伤的近期保护效应(再灌注0～72h)，而对心肌缺血再灌注损伤的远期效应及其分子机制尚未见报导。本研究发现临床相关浓度异氟烷可上调心肌细胞VEGF表达，将为吸入麻醉药的远期器官保护效应提供新的思路。VEGF上调可诱导内皮祖细胞增殖、迁移和趋化，促进缺血损伤心肌血管新生，改善缺血再灌注损伤后心室重构[9]。

[1] Kawata H， Yoshida K， Kawamoto A， et al. Ischemic preconditioning upregulates vascular endothelial growth factor mRNA expression and neovascularization via nuclear translocation of protein kinase C epsilon in the rat ischemic myocardium[J].Circ Res，2001，88(7)：696-704.

[2] Jamnicki-Abegg M，Weihrauch D，Pagel PS，et al.Isoflurane inhibits cardiac myocyte apoptosis during oxidative and inflammatory stress by activating Akt and enhancing Bcl-2 expression[J].Anesthsiology，2005，103(5)：1006-1014.

[3] Obal D，Weber NC，Zacharowski K，et al.Role of protein kinase C-epsilon(PKCepsilon) in isoflurane-induced cardioprotection[J].Br JAnaesth，2005，94(2)：166-173.

[4] Kanaya N，Gable B，Murray PA， et al.Propofol increases phosphorylation of troponin Iand myosin light chain 2 via protein kinase C activation in cardiomyocytes[J].Anesthesiology，2003，98(6)：1363-1371.

[5] Neufeld G， Cohen T， Gengrinovitch S， et al. Vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors[J].FASEB J，1999，13(1)：9-22.

[6] Uecker M，Da Silva R，Grampp T，et al.Translocation of protein kinase C isoforms to subcellular targets in ischemic and anesthetic preconditioning[J].Anesthesiology，2003，99(1)：138-147.

[7] Pravdic D， Sedlic F， Mio Y，et al.Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway[J].Anesthesiology，2009，111(2)：267-274.

[8] LudwigLM，Weihrauch D，Kersten JR，et al.Protein kinase C translocation and Src protein tyrosine kinase activation mediate isoflurane-induced preconditioning in vivo：potential downstream targets of mitochondrial adenosine triphosphate-sensitive potassium channels and reactive oxygen species[J].Anesthesiology，2004，100(3)：532-539.

[9] Grunewald M，Avraham I，Dor Y，et al.VEGF-induced adult neovascularization：recruitment，retention，and role of accessory cells[J].Cell，2006，124(1)：18-21.