氮氧自由基与氨基酸偶联物的设计合成与结构表征

景临林，马慧萍，樊鹏程，蒙　萍，贾正平

(兰州军区兰州总医院药剂科，甘肃 兰州 730050)



氮氧自由基与氨基酸偶联物的设计合成与结构表征

景临林，马慧萍，樊鹏程，蒙萍，贾正平*

(兰州军区兰州总医院药剂科，甘肃 兰州 730050)

摘要：将对甲酰基苯甲酸分别与氨基乙酸甲酯和4-氨基丁酸甲酯生成酰胺后，再分别与2,3-二甲基-2,3-二羟氨基丁烷进行缩合反应，最后经高碘酸钠氧化得到两种氮氧自由基与氨基酸偶联物，并通过IR、EPR、EI-MS和元素分析对目标化合物的结构进行了表征.

关键词：氮氧自由基；抑制性氨基酸；偶联物；合成

氮氧自由基(NN)是近年来发现的一种新型自由基清除剂，对·OH、O2-·、H2O2和NO均表现出较好的清除能力. 传统自由基清除剂通常通过化学量的方式清除活性氧(ROS)，NN则是利用电子转移在氧化态和还原态之间转换，以“催化”的方式不断清除ROS，具有拟超氧化物歧化酶(SOD)的效应[1]. 最新的研究表明，氮氧自由基可以减轻机体的氧化应激，对缺血再灌注损伤[2]、辐射损伤[3]具有明显的保护作用，同时还具有抗肿瘤[4]和抗病毒[5]活性. 本课题组前期研究发现氮氧自由基还可以显著缓解低压低氧导致的小鼠心脑组织损伤[6]. 缺氧条件下，神经递质代谢会出现紊乱，兴奋性氨基酸过量释放，细胞内Ca2+失稳态[7]. 甘氨酸和γ-氨基丁酸是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，能够抑制兴奋性氨基酸的毒性，同时可通过突触后膜超极化减少离子内流，从而缓解缺氧对脑组织的损伤[8]. 甘氨酸还对缺氧导致的心肌细胞损伤具有明显的保护作用，其机制可能是与减轻缺氧导致的细胞膜去极化，减少电压依赖性Ca2+通道的开放和Ca2+的内流有关[9].

为了获得抗缺氧活性更好的衍生物，本文作者以对甲酰基苯甲醛和两种抑制性氨基酸(甘氨酸和γ-氨基丁酸)为原料，根据药物拼合原理，将氨基酸分子引入到氮氧自由基结构中，合成了两种氮氧自由基与氨基酸偶联物，产物结构经IR、 EI-MS、EPR和元素分析确认. 目标化合物合成路线见图1.

1实验部分

1.1　仪器与试剂

DHJF-2005低温反应器，郑州长城科工贸有限公司；NEXUS 670红外光谱仪，KBr压片，美国Nicolet公司；ER200DSRC10/12电子顺磁共振波谱仪，瑞士Brucker公司；Vario EL cube元素分析仪，德国Elementar公司；Brucker AVANCE III 400核磁共振波谱仪，瑞士Brucker公司， LCMS-API 3200质谱仪，美国Applied Biosystems公司.

图1　氮氧自由基与氨基酸偶联物的合成路线Fig.1　Synthesis of nitronyl nitroxide-animo acid conjugates

CDCl3和DMSO-d6(TMS )购自Sigma公司；2-氨基乙酸甲酯盐酸盐、4-氨基丁酸甲酯盐酸盐、N-甲基吗啉和溴乙酸乙酯购自阿拉丁试剂公司，对甲酰基苯甲酸购自上海邦成化工有限公司；GF254高效板和柱层析硅胶，青岛海洋化工厂分厂；其他均为市售分析纯试剂. 无水THF经金属钠处理.

1.2　二甲基-2,3-二羟氨基丁烷按照文献[10]方法制备

1.3　2-(4-甲酰基苯甲酰胺基)丁酸甲酯(1)

将对甲酰基苯甲酸(0.75 g， 5 mmol)和氨基乙酸甲酯盐酸盐(0.74 g，6 mmol)溶于50 mL无水THF中，低温反应器冷却至0 ℃，用N-甲基吗啉调节pH=9. 缓慢滴加溶于20 mL 无水THF的DCC(1.22 g，6 mmol)，滴毕后0 ℃下继续搅拌2 h，然后升温至室温继续反应16 h，过滤，减压除去THF，残余物用少量二氯甲烷溶解后，快速柱层析分离(V石油醚∶VCH2Cl2∶V乙酸乙酯=1∶1∶1)，得白色粉末0.75 g，为化合物1，产率68%. ESI-MS(m/z)：222[M+H]+.1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ： 10.09(s， 1H)，7.94~7.99(m，4H)，6.94(s，1H)，4.27(d，J=5.2 Hz，2H)，3.82(s，3H).13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ： 191.5，170.3，166.4，138.65，138.30，129.8，127.8，109.71，52.53，41.73.

1.4　4-(4-甲酰基苯甲酰胺基)丁酸甲酯(2)

将对甲酰基苯甲酸(0.75 g，5 mmol)和4-氨基丁酸甲酯盐酸盐(0.92 g，6 mmol)溶于50 mL无水THF中，低温反应器冷却至0 ℃，用N-甲基吗啉调节pH=9. 缓慢滴加溶于20 mL 无水THF的DCC(1.22 g，6 mmol)，滴毕后0 ℃下继续搅拌2 h，然后室温下继续反应20 h，过滤，减压除去THF，残余物用少量二氯甲烷溶解后，快速柱层析分离(V石油醚∶VCH2Cl2∶V乙酸乙酯=1∶1∶1)，得白色粉末0.93 g，为化合物2. 产率75%. ESI-MS(m/z)：250[M+H]+.1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：10.08(s，1H)，7.95(s，4H)，6.94(s，1H)，3.68(s，3H)，3.52~3.56(m，2H)，2.49(t，2H)，1.96~2.03(m， 2H).13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ： 191.5，172.4，166.3，139.8，138.1，129.8，126.6，51.9，40.0，31.8，24.0.

1.5　2-(4-((2-甲氧基-2乙酰基)氨基甲酰基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-咪唑啉-3-氧-1-氧基自由基(NN1)

将1.10 g(5 mmol)化合物1和0.74 g(5 mmol)2,3-二甲基-2,3-二羟氨基丁烷溶于25 mL甲醇中，回流反应12 h. 减压除去甲醇，残余物悬浮于25.0 mL CH2Cl2中，低温反应器冷却至0 ℃，加入15.0 mL NaIO4(0.85 g)水溶液，剧烈搅拌15 min后停止反应. 静置分层后，水相用CH2Cl2萃取两次，合并有机相，无水Na2SO4干燥过夜，过滤，减压除去溶剂，得深蓝色固体或油状物，快速柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯= 7∶3)，得蓝色固体0.78g，为目标化合物NN1. 产率45%. m.p.： 145.1~146.3 ℃. ESI-MS(m/z)：349 [M+H]+. IR(KBr)：3 378，2 949，1 763，1 668，1 548，1 525，1 365，1 318，1 209，1 167，846 cm-1. EPR(CH3OH)：五重峰，g =2.006 8，|aN| =7.64 G. Anal. Calcd for C17H22N3O5：C，58.61；H，6.37；N，12.06. Found：C，58.68；H，6.51；N，12.72.

1.6　2-(4-((4-甲氧基-4-丁甲酰基)氨基甲酰基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-咪唑啉-3-氧-1-氧基自由基(NN2)

将1.24 g(5 mmol)化合物2和0.74 g(5 mmol)2,3-二甲基-2,3-二羟氨基丁烷溶于25 mL甲醇中，回流反应12 h. 减压除去甲醇，残余物悬浮于25.0 mL CH2Cl2中，低温反应器冷却至0 ℃，加入15.0 mL NaIO4(0.85 g)水溶液，剧烈搅拌15 min后停止反应. 静置分层后，水相用CH2Cl2萃取两次，合并有机相，无水Na2SO4干燥过夜，过滤，减压除去溶剂，得深蓝色固体或油状物，快速柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯=2∶1)，蓝色油状物0.99 g，为目标化合物NN2. 产率53%. ESI-MS(m/z)：377 [M+H]+. IR(KBr)：3 369，2 988，2 948，1 736，1 645，1 545，1 525，1 429，1 363，1 309，1 207，1 169，854 cm-1. EPR(CH3OH)：五重峰，g =2.006 8，|aN| =7.64 G. Anal. Calcd for C19H26N3O5：C，60.62；H，6.96；N，11.16. Found：C，60.68；H，6.85；N，11.12.

2结果与讨论

2.1　合成方法

醛和2,3-二甲基-2,3-二羟氨基丁烷经过缩合和氧化反应即可得到咪唑啉类氮氧自由基，这也是获得该类氮氧自由基的唯一方法. 合成过程中，为了简化反应操作，缩合和氧化反应采取一锅法进行，缩合产物不需分离纯化，直接进行氧化反应，最后经过一次柱层析即可得到纯度较高的目标化合物. 在该合成路线中，控制氧化过程，避免出现氧化不完全和过氧化反应，是能否高产率获得氮氧自由基的关键. 为了减少过氧化产物的生成，通过对反应条件的摸索，我们采取了以下三个措施：一是降低反应温度，氧化反应过程始终在0 ℃下进行，避免反应过于剧烈；二是使用二氯甲烷和水的混合溶剂作为反应体系，将生成的氮氧自由基及时萃取到CH2Cl2相中，尽可能减少与氧化剂高碘酸钠的接触；三是控制高碘酸钠的用量以及反应时间，最大限度地避免过氧化产物的生成.

2.2　结构表征

在化合物1和2的1H NMR谱中，10.00附近出现的单峰为醛基质子信号，6.90附近为酰胺键中质子信号，3.7 为酯基中甲氧基质子信号. 在13C NMR谱中，化合物1和2的酰胺基和酯基中羰基碳的位置分别为191.5，170.3和191.5，172.4. 酯基中甲氧基碳质子信号出现在52附近. 以上核磁数据与目标分子结构一致.

化合物NN1和NN2在核磁共振仪上没有信号，无法通过NMR对其进行结构表征. 在它们的红外谱图中，NN1和NN2中酰胺和酯基中羰基的特征吸收峰分别在1 668，1 763 cm-1和1 645，1 736 cm-1处出现， N-O键的典型吸收峰出现在1 360 cm-1附近，1 208和1 545 cm-1附近出现C-N和C=N键特征吸收峰，酰胺键中N-H的伸缩振动出现在3 370 cm-1，850 cm-1附近的单峰表明是苯环中为1,4取代结构. 电子顺磁共振(EPR)是观察和检测自由基等顺磁性物质的一种最直接、最有效的方法[11]. 化合物NN1的EPR谱呈现对称的五重峰，各峰强度比为1∶2∶3∶2∶1. 质谱和元素分析结果与目标分子一致.

图3　化合物NN1的EPR谱Fig.3　EPR spectrum of compound NN1

3结论

为了获得抗缺氧活性更加优异的新型氮氧自由基衍生物，以对甲酰基苯甲醛、2-氨基乙酸甲酯和4-氨基丁酸甲酯为原料，通过三步反应，将氮氧自由基与氨基酸分子通过酰胺键相连，合成得到两种新型氮氧自由基氨基酸偶联物，反应操作简单，条件温和，产物结构经波谱分析与目标化合物一致，为下一步对其进行抗缺氧活性研究奠定了基础.

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[责任编辑：任铁钢]

Synthesis and characterization of nitronyl nitroxide-amino

acid conjugates

JING Linlin, MA Huiping, FAN Pengcheng, MENG Ping, JIA Zhengping*

(DepartmentofPharmacy,LanzhouGeneralHospital,LanzhouCommandofCPLA,Lanzhou730050,Gansu,China)

Abstract:Synthesis was initiated with amidation reaction between 4-carboxybenzaldehyde and methyl glycinate or methyl 4-aminobutyrate respectively, followed by condensation with 2,3-dimethyl-2,3-dihydroxylamino butane yield the key intermediate compound 1 and 2, which was subsequently subjected to oxidize by sodium periodate to generate two nitronyl nitroxide-amino acid conjugates. The structure was characterized by IR, EI-MS, EPR and elemental analysis.

Keywords:nitronyl nitroxide; inhibitory amino acid; conjugate; synthesis

作者简介：景临林(1982-)，男，主管药师，主要从事药物合成研究.*通讯联系人,E-mail: zhengpingjia@163.com.

基金项目：国家自然科学 (81202458)，全军医药科研“十二五”面上项目(CLZ12JA04)，甘肃省自然科学基金(1308RJYA06)，中国博士后科学基金(2012M521926).

收稿日期：2015-06-24.

文章编号：1008-1011(2015)06-0597-04

中图分类号：O629. 9

文献标志码：A