肉苁蓉多糖锌的制备、表征及抗氧化活性

黄　靖，邹　烨，王　未，李　倩，吴慧玉，赵　婷，茆广华，张　敏，仰榴青*

(1．江苏大学 化学化工学院，江苏 镇江 212013；　2．江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；

3．江苏大学 药学院，江苏 镇江212013；　4.江苏大学 环境与安全工程学院，江苏 镇江212013)



肉苁蓉多糖锌的制备、表征及抗氧化活性

黄靖1，邹烨2，王未2，李倩2，吴慧玉3，赵婷1，茆广华4，张敏1，仰榴青1*

(1．江苏大学 化学化工学院，江苏 镇江 212013；2．江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；

3．江苏大学 药学院，江苏 镇江212013；4.江苏大学 环境与安全工程学院，江苏 镇江212013)

摘要：采用超声酶法辅助提取肉苁蓉粗多糖，并用季铵盐沉淀法对肉苁蓉粗多糖进行精制，获得肉苁蓉精制多糖(UCEP1)；以UCEP1和硫酸锌为原料，制备了肉苁蓉多糖锌配合物(UCEP1-Zn)，对其结构进行了表征，并研究其抗氧化活性. 结果表明，肉苁蓉粗多糖收率及含量分别为22.31%和48.50%，UCEP1中多糖含量为70.13%；UCEP1-Zn中-OH和-COO-和Zn2+发生了配位，其中锌含量为7.57%，且多糖链构象及多糖分子表面形貌发生变化；UCEP1-Zn的抗氧化能力显著高于UCEP1，且对ABTS+自由基清除活性最好. 该研究可为肉苁蓉多糖、新型锌营养素补充剂以及锌功能配合物的研究和利用提供参考.

关键词：肉苁蓉；多糖；锌；配合物；结构表征；抗氧化活性

Preparation, characterization and antioxidant activity of

管花肉苁蓉(Cistanchetubulosa(Schrenk) R. Wight)属列当科寄生植物，主要分布于非洲北部和亚洲西部[1]. 它干燥带鳞叶的肉质茎中的活性物质(如多糖)能够促进血液循环、治疗阳痿、腰痛和不孕不育等疾病[2]. 多糖主要存在于动物、植物和微生物中，具有较高的安全性、低毒性、可降解性和高度生物相容性. 多糖因具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、提高免疫等生物活性[3-9]，而引起人们的广泛关注. 微量元素是人体所需营养成分中的重要组成部分，是生命体消化过程中能量转换和组织构成的重要因素，其中锌是生物正常生长发育所必须的微量元素之一，是人体内酶的激活剂，对维持人体正常生理功能，提高免疫力，促进身体与智力发育具有重要的作用[10]. 本文作者采用肉苁蓉精制多糖(UCEP1)与锌(II)制备肉苁蓉多糖锌配合物(UCEP1-Zn)，对肉苁蓉多糖及其锌配合物进行结构表征，并研究其抗氧化活性，该研究可为肉苁蓉多糖、新型锌营养素补充剂以及锌功能配合物的研究和利用提供参考.

1实验部分

1.1　仪器和试剂

Nicolet 470傅立叶变换红外光谱仪，美国Nicolet公司；JASCO J-810-150S圆二色谱仪，日本JASCO公司；MFP-3D扫描探针显微镜，美国Asylum Research公司；JSM-7001F型热场发射扫描电子显微镜，日本电子株式会社(JEOL)；BDX3300 X射线衍射仪.

肉苁蓉茎购于新疆草本植物市场，经镇江食品药品监督管理局主任中药师陈黎鉴定为列当科苁蓉属管花肉苁蓉；硫酸锌、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、乙二胺四乙酸二钠、氨水、氯化铵、铬黑T、无水乙醇、95%乙醇、邻二氮菲、七水合硫酸亚铁、30%双氧水、过硫酸钾(K2S2O8)、氯化钠、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；DPPH、ABTS购自Sigma-Aldrich公司.

1.2　实验方法

1.2.1肉苁蓉粗多糖的超声纤维素酶法提取及精制

超声酶法辅助提取肉苁蓉多糖：准确称取10.0 g肉苁蓉粉末，置于500 mL圆底烧瓶中，加入2.5%(g/mL)纤维素酶，按料液比1∶30(g/mL)加入去离子水，调pH为6.0，设定超声温度为50 ℃，超声酶解0.5 h. 提取结束后，100 ℃冷凝回流，搅拌提取2 h. 4 000 rpm离心10 min，旋转蒸发，醇沉. 离心得沉淀，挥醇，冷冻干燥得肉苁蓉粗多糖(UCEP). 实验平行3次，按公式(1)计算多糖得率并采用苯酚硫酸法测定其含量[11].

内苁蓉多糖得率(%)=

(1)

三氯乙酸法脱蛋白：在冰浴、搅拌的条件下向UCEP溶液中逐滴加入15%的三氯乙酸，使其多糖溶液pH=1，4 ℃静置4 h，4 500 rpm 离心20 min，收集上清液，在波长190~400 nm范围内扫描，观测280和260 nm 处是否有吸收峰. 将脱蛋白后的多糖溶液用透析袋流水透析48 h，双蒸水透析48 h，冷冻干燥得到肉苁蓉多糖.

季铵盐沉淀法精制肉苁蓉多糖：将3%(g/mL)的CTAB溶液等体积加入0.8%(质量浓度)的肉苁蓉粗多糖溶液中，静置12 h，10 000 rpm 离心5 min，收集上清液，醇沉，4 ℃静置12 h，4 000 rpm 离心10 min收集沉淀. 沉淀经溶解、透析、冻干后得到精制多糖UCEP1，测定其多糖含量.

1.2.2肉苁蓉多糖锌的制备

准确称取0.25 g UCEP1置于100 mL圆底烧瓶中，加入25 mL去离子水使多糖溶解. 加入等体积的0.45 mol/L硫酸锌溶液，室温搅拌反应4 h，将反应液流水透析24 h，双蒸水透析24 h. 收集透析后的液体，冷冻干燥，即得UCEP1-Zn[12].

1.2.3肉苁蓉多糖及其锌配合物的结构表征

取适量干燥的UCEP1和UCEP1-Zn样品，与烘干的KBr粉末以1∶100混合研磨均匀，压片，使用红外光谱(FT-IR)，在波长在400~4 000 cm-1范围内扫描分析峰位置的变化，并在室温下用X射线衍射仪(XRD)记录峰强度与峰位置的变化，X射线源为高强度Cu Kα线，测试电压为40 kV，电流为30 mA，RS为0.3 mm，DS和SS为1°，扫描速率为7 °/min，扫描范围为5°~90°. 使用EDTA滴定法测定UCEP1-Zn中锌的含量，锌含量按公式(2)计算：

(2)

将UCEP1和UCEP1-Zn配制成100 mg/L的溶液，采用圆二色谱仪(CD)进行测定，将色谱仪参数设定为：扫描波长190~250 nm，带宽2.5 nm，时间常数2 s，扫描速率50 nm/min. 取3.0~5.0 μL样品液滴在新鲜解离的云母片上，室温干燥2 h. 采用原子力显微镜(AFM)于室温下直接观测多糖的分子形貌，接触作用力控制在3~4 nN量级范围内，共振频率为2.0 kHz. 将UCEP1和UCEP1-Zn样品粘着于样品盘上，置于真空喷镀仪内镀导电金膜，采用热场发射扫描电子显微镜(SEM)观察.

1.2.4肉苁蓉多糖及其锌配合物的抗氧化活性

参考文献清除DPPH、OH和ABTS+自由基能力的测定分别[13]、[14]和[15]进行.

2结果与讨论

2.1　肉苁蓉多糖的超声酶法提取及精制

在本文工艺下，超声酶法辅助提取肉苁蓉多糖的得率为22.31%，多糖含量为48.50%. 除蛋白后的肉苁蓉多糖溶液在波长260和280 nm处无吸收. 经过季铵盐沉淀后，精制多糖UCEP1中多糖含量为70.13%，比粗多糖含量提高了44.59%.

2.2　肉苁蓉多糖及其锌配合物的结构表征

图1为UCEP1与UCEP1-Zn的红外光谱. 如图所示，UCEP1位于3 387 cm-1处的宽峰是-OH的伸缩振动吸收峰，位于1 637 cm-1处的峰为-COO-的反对称伸缩振动峰. UCEP1-Zn的红外光谱与UCEP1相比主要差别为：1) UCEP1位于3 387 cm-1左右处的宽峰是-OH的伸缩振动峰，UCEP1-Zn中该吸收峰移至3 375 cm-1，表明UCEP1中的-OH参与了与Zn2+的配位；2) UCEP1位于1 637 cm-1的峰是-COO-的反对称伸缩振动峰，UCEP1-Zn中该峰向低波数位移至1 631 cm-1，表明多糖链中-COO-参与了与Zn2+的配位. 图2是UCEP1与UCEP1-Zn的XRD图谱. 根据标准图谱(PDF#22-1019)可知，ZnSO4·7H2O的XRD图谱共有6个强锐峰，分别位于衍射角2θ值为19.89°、20.98°、21.60°、25.88°、31.03°和33.54°处，此外2θ位于10°~90°之间还存在一些小峰. 由图可知，UCEP1 有3个峰，分别位于2θ值为12.98°、29.72°与42.88°处. 相比 29.72°和42.88°处的两个宽峰，2θ位于12.98°的峰相对较为尖锐. 多糖锌UCEP1-Zn的强锐峰位于13.35°，其原因是ZnSO4·7H2O加入后与肉苁蓉多糖发生配位作用，形成了多糖锌配合物，从而使得原本的晶格参数发生变化，其2θ由12.98°变化为13.35°. 且UCEP1-Zn的XRD图谱中没有发现ZnSO4·7H2O的特征衍射峰，表明Zn2+与UCEP1发生配位作用，并且Zn2+在糖链上高度分散.

图1　UCEP1与UCEP1-Zn的红外光谱图Fig.1　Infrared spectra of UCEP1 and CEP1-Zn

图2　UCEP1与UCEP1-Zn的X射线衍射图Fig.2　X-ray diffraction patterns of UCEP1 and UCEP1-Zn

采用络合滴定法测定肉苁蓉多糖锌UCEP1-Zn中的锌含量，其值为7.57%. 李志洲等[10]研究了牛肝菌多糖锌配合物的制备，测得锌配合物中锌含量为2.64%，低于本文中合成的肉苁蓉多糖锌中的锌含量.

图3为UCEP1与UCEP1-Zn在190~300 nm范围内的圆二色谱图. 如图所示，与UCEP1相比，UCEP1-Zn在210~220 nm之间的峰值明显降低，此现象说明多糖与锌形成配合物，使得多糖分子的不对称性增加，导致多糖链的构象发生了变化. 图4A与4B分别为UCEP1与UCEP1-Zn在水溶液中的原子力显微电镜照片. 在低浓度下，UCEP1多糖分子为均一颗粒状，且分子间具有柔顺性，而UCEP1-Zn分子有着可辨别的单个聚合物，其分子间不是简单的叠加，而是分子间的相互作用. 图5A和5B分别为UCEP1及UCEP1-Zn的扫描电镜图. 如图5所示，UCEP1及UCEP1-Zn的表面形貌发生了明显变化，由图5A可知，肉苁蓉多糖以纤维棒状结构存在，纤维棒状表面光滑. 当多糖与锌发生配合作用后(图5B)其表面变粗糙，且通过图6的能谱分析可知其表面结合了锌.

图3　UCEP1与UCEP1-Zn的圆二色谱图Fig.3　CD spectra of UCEP1 and UCEP1-Zn

A: UCEP1; B: UCEP1-Zn.图4　UCEP1与UCEP1-Zn的原子力显微镜图Fig.4　The AFM images of the polysaccharides and complexes

A: UCEP1; B: UCEP1-Zn.图5　UCEP1与UCEP1-Zn的扫描电镜图Fig.5　SEM micrographs of the polysaccharides and complexes

图6　UCEP1-Zn的能谱成分分析图Fig.6　Energy spectrum analysis of UCEP1-Zn

2.3　UCEP1-Zn的抗氧化活性

清除DPPH·能力测试如图7所示，在50~1 000 mg/L范围内，UCEP1-Zn对DPPH·的清除能力高于UCEP1；当浓度为1 000 mg/L时，UCEP1-Zn对DPPH·清除率达到33.71%，比配合前的多糖清除率提高16.24%. 清除·OH能力测定如图8所示，在50~1 000 mg/L 范围内，UCEP1-Zn对OH·的清除能力高于UCEP1；当浓度为1 000 mg/L时，UCEP1-Zn对·OH清除率达到34.49%，比UCEP1清除率高18.72%. 清除ABTS+能力测试如图9所示，在50~1 000 mg/L范围内，UCEP1-Zn对ABTS+的清除能力高于UCEP1；当浓度为1 000 mg/L时，UCEP1-Zn对ABTS+清除率达到36.83%，比UCEP1的清除率高18.80%.

图7　UCEP1和UCEP1-Zn对DPPH·的清除能力Fig.7　DPPH· radical scavenging capacity of UCEP1 and UCEP1-Zn

图8　UCEP1和UCEP1-Zn对OH·的清除能力Fig.8　OH· radical scavenging capacity of UCEP1 and UCEP1-Zn

UCEP1中含有羟基和羧基，作为给电子体，能与自由基作用达到清除自由基的效果，而UCEP1与锌配位后，其羟基和羧基的给电子作用减弱，但清除自由基的能力反而增大，可能是UCEP1与锌配合后，使配位部分与暴露的活性基团协同作用，促进与自由基的作用，因而清除自由基的能力增大[16]；另一方面，UCEP1与锌配合后，与自由基反应生成的中间体可能更加稳定，导致清除自由基的能力增大[17].

图9　UCEP1和UCEP1-Zn对ABTS+的清除能力Fig.9　ABTS+ radical scavenging capacity of UCEP1 and UCEP1-Zn

3结论

采用超声酶法辅助提取肉苁蓉粗多糖，其多糖得率及含量分别为22.31%和48.50%. 经铵盐沉淀法精制获得肉苁蓉精制多糖(UCEP1)，其多糖含量达70.13%. 得到的肉苁蓉多糖锌配合物UCEP1-Zn，UCEP1中-OH和-COO-与Zn2+发生了配位，EDTA滴定法分析其锌含量为7.57%. UCEP1-Zn形成后，多糖链构象及多糖分子表面形貌发生变化. 体外抗氧化活性研究表明，UCEP1-Zn的抗氧化能力显著高于UCEP1，且对ABTS+自由基清除活性最高. 该研究可为肉苁蓉多糖、新型锌营养素补充剂以及锌功能配合物的研究和利用提供参考.

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[责任编辑：吴文鹏]

CistanchetubulosaZn2+-polysaccharide complex

HUANG Jing1, ZOU Ye2, WANG Wei2, LI Qian2, WU Huiyu3,

ZHAO Ting1, MAO Guanghua4, ZHANG Min1, YANG Liuqing1*

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu,China;

2.SchoolofFoodandBiologicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu,China;

3.SchoolofPharmacy,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu,China;

4.SchoolofEnvironmentandSafetyEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu,China)

Abstract:Cistanche tubulosa polysaccharides was extracted by ultrasonic-cellulase-assisted extraction and the refined polysaccharide (UCEP1) was prepared by quaternary ammonium salt precipitation. The Zn2+-polysaccharide (UCEP1-Zn) was prepared with ZnSO4and UCEP1 as raw material, and its characterization and antioxidant activity were also studied. The results showed that the yield and content of cistanchetubulosa polysaccharides was 22.31% and 48.50%, respectively, and the content of UCEP1 was 70.13%. The -OH group and the carboxyl group were involved, the chain conformation and variation on morphology were also changed after the formation of UCEP1-Zn, and the content of Zn2+was 7.57%. The antioxidant activity of UCEP1-Zn was significantly higher than that of UCEP1 and had the highest ABTS+radical scavenging activity. The study provided a reference for the research and application of Cistanche tubulosa polysaccharide, zinc supplement and zinc complexes.

Keywords:Cistanche tubulosa； polysaccharide; Zn; complex; characterization; antioxidant activity

作者简介：黄靖(1990-)，女，硕士生，主要从事天然产物化学及应用研究.*通讯联系人，E-mail：yangliuqing@ujs.edu.cn.

基金项目：浙江省科技计划项目(2012C22008), 镇江市科技计划项目(GY2012002).

收稿日期：2015-04-29.

文章编号：1008-1011(2015)06-0584-06

中图分类号：O69

文献标志码：A