Agrin在神经系统损伤后修复中的作用*

杨利强，　张彭跃

(昆明理工大学医学院，云南　昆明　650500)



·综述·

Agrin在神经系统损伤后修复中的作用*

杨利强，张彭跃△

(昆明理工大学医学院，云南昆明650500)

[关键词]聚集蛋白； 神经系统损伤； 突触再生

神经系统主要由中枢神经系统(central nervous system，CNS)和周围神经系统(peripheral nervous systems，PNS)两大部分组成。CNS损伤包括脊髓损伤和脑神经损伤，主要以后者为主，具有发病率高、致残率高和死亡率高的特点。此外，CNS损伤后会引起包括DNA降解和细胞膜磷脂酰丝氨酸残基早期暴露在内的一系列程序性细胞死亡的病理过程，进而加重神经元继发损伤，加剧神经功能缺失症状[1]。PNS损伤后会造成支配区无力、神经痛等后遗症[2]。同时会引起神经轴突和神经血管束损伤，这些坏死的周围神经组织会发生脱落和纤维化导致神经再生受阻[3]，阻碍神经功能恢复。因而，神经系统损伤后会严重影响患者的生存质量，并且对家庭和社会造成了重大负担。因此，寻求神经系统损伤后修复的有效治疗方案是当前研究的重点。

早期研究认为CNS损伤后不具有再生修复功能，而外周神经元则具有功能性再生的能力[4]。直到1958年，Liu等[5]首次证实成年哺乳动物CNS损伤后仍然具有可塑性，提示CNS损伤后存在自身的再生和修复，而神经元和突触的再生是神经系统损伤后修复研究的重要环节。此后，通过不断研究，科学家从细胞学、分子生物学和结构学上，对轴突的再生过程有了进一步的认识[6]。虽然目前CNS损伤后修复的研究有了一些突破性进展，但是尚不能取得满意的临床疗效。如何促进中枢神经再生以及提高损伤修复的临床效果，是神经科学研究者迫切需要解决的问题。聚集蛋白(agrin)是一个关键的突触形成和稳定蛋白，在PNS的神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)发育、发生和稳定中起着重要作用，最近研究发现，agrin在CNS损伤后修复中也起着不可或缺的作用。因此，agrin在神经系统损伤后修复过程中的作用及相关分子机制已经日益引起大家的关注。本文就agrin在神经系统损伤后修复过程中的作用及分子机制的相关研究进行简要综述，为神经系统损伤的临床治疗提供理论依据

1Agrin的结构与表达

Agrin是一个以硫酸乙酰肝素蛋白多糖为核心蛋白的细胞外基质蛋白，相对分子质量大约为220 kD，拥有9个蛋白激酶抑制剂结构域、4个表皮生长因子样结构域和1个黏附分子G同源结构域[7]。其N端主要由9个促卵泡激素重复序列构成，其中含有1个与K型蛋白酶抑制剂同源的序列区，该区介导了agrin与基底黏连蛋白的结合，而C端含有3个黏附分子G同源结构域和4个富含半胱氨酸的类表皮生长因子重复序列区，该区域可以与肝磷脂发生结合[8]，然后激活肌肉特异性激酶(muscle-specific kinase,MuSK)，诱导乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AChR)在突触后膜聚集[9]。

Agrin编码的基因通过不同的外显子剪切模式会形成2种不同的表达形式：膜蛋白和分泌蛋白。在CNS中广泛存在，主要以膜蛋白为表达形式，并且在发育的不同阶段表达呈现不同的特点[10]。而在NMJ部位主要以分泌蛋白形式表达[11]，由运动神经元合成，在NMJ沉积，可使AChR在突触后膜聚集[12]。不同外显子剪切模式不仅影响agrin的表达形式，而且对agrin的亚型也有决定性作用。Agrin具有3个剪切位点，由编码基因外显子通过不同的剪切会形成不同的亚型，在小鼠中3个位点指x、y和z；而在鸡中则是X、A和B。在这些剪切位点处的少量氨基酸序列的插入会导致agrin具有不同的结构类型，并且对agrin的生物学活性具有较大的影响。有研究证实，在小鼠z的剪切位点选择性剪切并插入氨基酸的agrin异构体拥有使AChR聚集的能力，并能够导致活体突触后膜发生分化[13]。Agrin及其异构体的表达水平具有高度的组织特异性，但是仅仅神经元细胞表达的agrin异构体具有高度的AChR聚集活性。因此，研究清楚神经源性agrin对与突触的诱导、分化作用，对于促进神经系统损伤后修复具有重要的价值。

2Agrin发挥生物学特性的方式

Agrin广泛存在于NMJ处，且能够引起AChR的聚集。那么这些引起AChR聚集的agrin是如何发挥其生物学特性的呢？研究发现AChR在NMJ的浓度为1～10 pmol/L，而agrin的浓度是其1/100～1/50[14]，证明在agrin信号通路上可能存在一种放大机制，而酪氨酸磷酸化在其中可能发挥了重要的作用。Agrin能够激活AChR的β亚单位酪氨酸磷酸化，当加入酪氨酸激酶抑制剂可阻滞agrin产生的AChR聚集[15]。因此，agrin在NMJ发挥生物学特性的方式，可能是通过受体与配体相结合，产生一系列级联反应，逐级放大，引发相应的生物学效应。所以，与agrin相结合的配体是agrin信号通路的关键。

通过配体结合技术发现，营养不良聚糖(dystroglycan)能够与agrin相结合。其结合方式为α-dystroglycan通过钙依赖与agrin结合，另一端则与β-dystroglycan连接。而细胞外营养不良蛋白(dystrophin)和肌营养不良相关蛋白(utrophin)则通过β-dystroglycan连接在质膜上，引起一系列级联反应。α-dystroglycan与agrin的结合对于agrin引导突触的分化可能具有十分重要的意义[16]。

3Agrin在神经肌肉接头形成和损伤修复中的作用

McMahan[17]通过研究提出在NMJ间隙处的神经源性因子agrin对促进AChR在神经支配区域的聚集和稳定起着重要作用。有研究表明agrin不仅在AChR聚集方面起作用，而且在NMJ处的神经发育、发生和稳定中也起着关键作用[18]。Agrin通过与突触后膜受体dystroglycan相结合可使AChR发生聚集、重排，从而使膜结构稳定，进而促进神经突触的发育和形成。而MuSK在AChR集群形成的过程中起到不可或缺的作用[19]。

MuSK是一种跨膜AChR偶联酪氨酸激酶，选择性地由发育中的骨骼肌细胞表达并聚集在突触后膜上[20]。Agrin能够使MuSK快速发生磷酸化。只有当MuSK被磷酸化激活后，才会发生细胞内信号级联反应，从而导致一系列蛋白磷酸化,促使AChR发生聚集，这一过程由正反馈活动负责调节[21]。Agrin除了对MuSK的调节，还对一些重要的转录调控蛋白进行调控。Agrin在进行其它调控之前，必须接受其它刺激激活才能发挥作用。有研究发现agrin的激活需要依赖于多个胞内信号途径的参与，其中包括促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等磷酸激酶分子参与[22]。

Agrin不仅促进NMJ的正常发育，而且还参与突触损伤后的修复过程。神经元损伤后的修复重建，需要大量具有不同投射模式的新突触的重新形成。在这个过程中agrin对轴突起到引导作用，是其生长导航的关键分子[23]。此外，agrin还与大量的细胞表面蛋白结合，对生长因子和受体的相互作用起到促进作用[24]。Agrin可以调控和引导轴突的体内生长，但是此过程还需要其它分子信号的参与。Agrin可能是通过激活胞内信号通路，使一些与生长相关的转录激活因子磷酸化，从而被激活，进而引起核内转录谱发生改变，诱导更多生长相关因子和蛋白的表达，从而促进突触再生，对神经系统损伤进行修复。

4Agrin在中枢神经系统形成和损伤修复中的作用

CNS损伤后，在损伤区域会造成大量神经细胞和髓鞘的碎片出现，同时迅速激活星形胶质细胞和小胶质细胞，并分泌出大量细胞外基质蛋白，形成不利于突触再生的抑制性环境，阻止损伤区域的轴突生长和突触再生[25]。然而，近年来有研究发现，在这个神经轴突/突触再生的抑制性环境中也存在一些促进突触再生的因素，包括多种神经营养因子，如神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等[26]。因此增加这些有利因子的表达，可以促进突触的再生。

Agrin在CNS中也广泛存在，并且在其中具有不可或缺的作用，参与多个方面神经元的分化和功能发挥，agrin在轴突生长锥、突触形成部位以及成年动物脑内突触可塑性部位都有大量表达，同时也参与CNS突触的再生[27]。神经系统损伤后修复的最终目的是重建神经网络的功能，而突触再生是重建神经网络的关键。因此，agrin在神经系统损伤后功能的修复方面具有十分重要的作用。

体外研究证实，agrin在体外培养的海马神经元中调控其树突的生长、分支以及突触的形成，当agrin的表达被抑制后丝状伪足的形成及其数量发生明显的减少[28]。在大鼠脑外伤模型中，发现在海马去神经支配的区域agrin的表达显著上升，而且与损伤后突触再生的时间窗相吻合，通过亚细胞结构定位研究也表明，这些上调的agrin表达主要集中在突触连接的部位[29]。最近有研究表明，新生神经元在嘴侧迁移流的迁移过程中agrin的表达量明显上升，大量表达的agrin通过与其相应的受体作用整合到已存在的嗅球神经网络，然而缺乏agrin的神经元也能够正确到达嗅球，但是却不能与嗅球神经网络相互整合从而迅速被清除[30]。这些研究表明agrin在中枢神经系统损伤后促进突触再生的过程中起着重要作用。那么agrin是通过怎样的途径发挥作用的呢？

环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic AMP response element binding protein，CREB)是含碱性亮氨酸拉链结构的转录因子[31]，是agrin的下游蛋白。在离体培养的海马神经元中，agrin可促使CREB磷酸化，从而促进培养的海马神经元树突延长[32]。CREB是一个重要的转录调控蛋白，其激活会导致编码神经保护分子的基因表达，如抗凋亡蛋白Bcl-2，这样有助于损伤后神经元的存活，改善神经功能的恢复[33]。

有研究表明，CREB在海马神经元中磷酸化激活的同时还激活了多个重要的神经营养因子的表达，如NGF[34]、BDNF[35]等。NGF对神经元的发育和生存、轴突的生长以及突触的重构和功能起着重要作用[36]。CNS受损后，NGF主要通过促进突触素p38的表达[37]和生长相关蛋白43(growth-associated protein，GAP-43)的产生，来促进神经的生长和再生。此外，Kuczewski 等[4]通过动物实验研究表明海马神经元的树突能够释放BDNF，产生的BDNF对突触的发生也具有促进作用[38-39]。发生的机制可能与BDNF调控神经突触内细胞骨架蛋白的合成、分布与重排有关[40]。BDNF在CNS缺血损伤和修复过程中也具有关键作用[41]，通过抑制神经元坏死[42]，神经保护效应，以及调节突触的修复再生，促进CNS损伤修复。因此，这些证据表明神经系统损伤后可能存在agrin→CREB→神经营养因子→突触再生通路，通过调控这一通路促进损伤后突触再生，从而促进功能恢复。

5小结与展望

综上所述，在CNS损伤后激活的agrin可通过上调损伤区域神经营养因子表达促进突触再生，改善功能的恢复。而在PNS，agrin在NMJ除了使AChR聚集，还可以调控和引导轴突体内的生长，促进突触再生。Agrin在促进神经功能恢复过程中可能机制是agrin蛋白的表达上升，然后通过胞内信号分子级联反应使CREB磷酸化，从而促进核内促突触生长相关蛋白的表达，最终增加损伤区域神经突触的再生，促进神经功能的恢复。Agrin在NMJ的形成方面已经取得丰硕成果，但是在PNS损伤修复方面很少有提及，关于其中涉及的机制待进一步研究。目前研究表明agrin在损伤区域突触再生方面具有不可缺少的作用，但是对其具体的分子机制需要深入研究。因此，进一步明确agrin在神经系统损伤修复方面的作用及其促进脑功能重建的相关分子机制，能够为神经系统损伤的临床治疗提供理论依据和方向上的指导。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Role of agrin in repair of nervous system injury

YANG Li-qiang, ZHANG Peng-yue

(MedicalFaculty,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China.E-mail:zpy19802000@sina.com)

[KEY WORDS]Agrin; Nervous system damage; Synaptic regeneration

[ABSTRACT]Agrin plays an important role in the development, occurrence and stability of the neuromuscular junction. It also plays an indispensable role in the central nervous system. In the repair process of the nervous system injury, agrin maintains the integrity of the blood-brain barrier, promotes synaptic regeneration of damaged areas, and improves the injured neural networks, which contributes to brain area remodeling and neurological function recovery. In this paper, we briefly review the role and possible mechanism of agrin in nervous system damage and repair process.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1142- 05

[收稿日期]2015- 12- 14[修回日期] 2016- 03- 24

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81460351)

通讯作者△Tel: 0871-65936881； E-mail: zpy19802000@sina.com

[中图分类号]R743.3; R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.031