中胚层分化蛋白2对视网膜色素上皮细胞吞噬功能的影响*

陈秀萍，　袁源智，　王历阳，　袁　非

(复旦大学附属中山医院眼科，上海 200032)



中胚层分化蛋白2对视网膜色素上皮细胞吞噬功能的影响*

陈秀萍，袁源智，王历阳，袁非△

(复旦大学附属中山医院眼科，上海 200032)

[摘要]目的： 观察中胚层分化蛋白2对视网膜色素上皮细胞吞噬功能的影响。方法: 采用人D407细胞和体外培养新生小鼠视网膜色素上皮细胞，加入不同剂量的纯化中胚层分化蛋白2，通过共聚焦显微镜及流式细胞术观察视网膜色素上皮细胞结合和内吞视杆细胞外节盘膜的情况。结果: 中胚层分化蛋白2主要表达在视杆细胞外节盘膜层，与视杆细胞外节盘膜生物标志物视紫红质完全共定位，纯化的中胚层分化蛋白2可刺激人D407细胞及小鼠原代视网膜色素上皮细胞吞噬视杆细胞外节盘膜，吞噬体生物标志物Rab7与摄入的视杆细胞外节盘膜共定位，D407细胞吞噬视杆细胞外节盘膜与中胚层分化蛋白2的浓度呈剂量依赖性，但在达到饱和浓度后其吞噬能力下降，中胚层分化蛋白2可结合至视杆细胞外节盘膜及D407细胞表面。结论: 中胚层分化蛋白2对视网膜色素上皮细胞吞噬功能有促进作用。

[关键词]中胚层分化蛋白2； 吞噬； 视网膜色素上皮细胞

吞噬(phagocytosis)是一个重要的生物学过程，可以清除凋亡细胞、细胞碎片和有害代谢产物，维持组织的平衡，损伤的修复和先天免疫平衡[1-2]。吞噬功能障碍可能导致代谢废物堆积，自身免疫性疾病及组织变性。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的吞噬作用对维持视网膜稳态和感光体活力是必需的[3]。RPE功能受损，消化后的代谢物不能及时清除，形成脂褐质和玻璃膜疣，继而Bruch膜与色素上皮细胞变性, 是发生年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)的重要因素。

低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)受体家族的所有成员都被视为细胞表面胞吞受体，其在细胞吞噬中起到重要作用，例如最早发现的人LDL受体，其介导含胆固醇的脂蛋白颗粒的内吞作用；中胚层分化蛋白2(mesoderm development candidate 2，Mesdc2)是LDL受体家族低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL receptor-related protein, LRP)的内质网(endoplasmic reticulum，ER)分子伴侣[4]，已被报道与LRP5、LRP6[5]及LRP4[6]结合。

本研究使用人D407细胞及原代小鼠RPE细胞，证实了Mesdc2可促进RPE细胞吞噬，Mesdc2主要表达在感光细胞外节段(photoreceptor outer segment，POS)的细胞质，可促进D407 RPE细胞和原代RPE细胞吞噬POS盘膜，其减少极有可能是RPE细胞吞噬功能下降的一个重要原因。

材料和方法

1材料

C57BL/6小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司提供)，6～8周龄及7～10日龄。 人D407细胞、HEK293细胞和新鲜牛眼(上海富衡生物科技有限公司提供)。

2主要试剂与仪器

DMEM培养液(Gibco)；MEM培养液、聚L-赖氨酸和蛋白酶抑制剂(Sigma)，胎牛血清(天津TBD公司)；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)和pHrodo标记盒(Thermo Fisher)；RIPA缓冲液裂解液(Pierce)；TCS SP5共聚焦显微镜及其软件分析系统 LAS AF (Leica)。

3方法

3.1Mesdc2质粒制备及蛋白提纯用RT-PCR产生的小鼠Mesdc2 cDNA通过PCR扩增与C末端FLAG标签相连，并用BglⅡ和NotⅠ位点克隆到pEGFP-N1质粒(Clontech)，以取代GFP，生成Mesdc2-FLAG质粒。另外，编码序列通过PCR扩增，用BglⅡ和XhoⅠ消化，克隆至pMAL-C4E质粒(New England Biolab)的BamH Ⅰ、SalⅠ和XbaⅠ位点，组成麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein, MBP) -Mesdc2质粒。所有的质粒通过DNA测序验证。将MBP-Mesdc2和pMAL-C4E质粒转化到BL21(DE3)细菌，之后用IPTG诱导，使用直链淀粉柱纯化MBP-Mesdc2和MBP蛋白，用PBS透析，并用SDS-PAGE进行分析。

3.2原代小鼠RPE细胞培养用CO2处死10日龄C57BL/6小鼠，立即取出眼球，在无菌状态下沿锯齿缘将眼球剪开，弃去角膜，晶状体和视网膜后，将胰蛋白酶加入RPE眼杯37 ℃消化3 min，10%胎牛血清终止消化，用吸管轻轻吹打，使RPE细胞脱落分离成单个细胞，离心后收集细胞，加入MEM(含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、青霉素/链霉素、重组人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)10 μg/L、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)1 μg/L、1×N1 Supplement、牛磺酸210 μg/L、氢化可的松1.2 mg/L和三碘甲状腺氨酸60 μg/L)，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。将培养基每2～3 d更换1次，直到RPE细胞长出。用胰蛋白酶解离细胞，在吞噬实验前3 d更换无bFGF和EGF的培养基。

3.3POS盘膜提取取死亡24 h内新鲜牛眼，4 ℃下，将分离的视网膜轻轻地在含有2.5%蔗糖的PBS中振荡15 min，移去视网膜之后，分离的POS盘膜经过2次38 700×g离心30 min收集并洗涤。纯化的POS盘膜用pHrodo标记盒标记[7]。POS盘膜与pHrodo(500 μg)孵育30 min后，于室温下在含1% BSA的PBS中孵育15 min。在吞噬实验前30 min该标记的盘膜用PBS 16 000×g离心5 min洗涤2次。

3.4RPE细胞吞噬POS盘膜实验采用双重荧光标记法。分别用pHrodo和DAPI标记POS盘膜及RPE细胞。将D407细胞或原代RPE细胞接种在预先涂有聚L-赖氨酸玻璃片的12孔板，培养过夜，待细胞生长孵育至80%融合时，将MBP-Mesdc2及MBP按所示浓度分别与pHrodo标记POS盘膜(50 mg/L)加入到RPE细胞37 ℃、5% CO2培养箱中孵育3 h，4 h时用PBS充分冲洗，将游离的POS盘膜去除，将细胞用4%多聚甲醛固定10 min，PBS冲洗干净，细胞核用DAPI染色，通过共聚焦显微镜及流式细胞术分析。胞内pHrodo信号通过ImageJ软件分析。

吞噬功能分析按参考文献的方法[8]，采用Leica TCS SP5 共聚焦显微镜及 LAS AF软件系统进行拍摄，每组随机拍摄5个视野，并选取中间的一组进行统计。采用ImageJ软件定量分析每幅图像中的荧光量。每幅图像中的吞噬荧光量/每幅图像中DAPI荧光量即为荧光密度。

3.5免疫组化荧光标记和免疫共定位实验取6～8周龄C57BL/6小鼠于麻醉下用10%福尔马林灌注心脏。眼球在相同固定液中4 ℃过夜，去除角膜和晶状体后，将眼杯孵育蔗糖梯度溶液10%和20%各3 h；30% 4 ℃过夜，然后进行3轮冻融和OCT包埋，制成7 μm厚的冰冻组织切片。分别用兔抗Mesdc2和小鼠抗视紫红质的抗体孵育，再用Alexa594标记的山羊抗兔IgG抗体和Alexa488标记的山羊抗小鼠IgG抗体，细胞核用DAPI标记，通过共聚焦显微镜分析荧光信号。

采用3种荧光标记，分别用pHrodo标记POS盘膜，DAPI标记RPE细胞，D407细胞与pHrodo标记POS盘膜共同孵育3 h，4%多聚甲醛固定10 min，用含有1%Triton X-100的PBS透化，再加入抗Rab7抗体，然后通过FITC标记的 II 抗定位Rab7。通过共聚焦显微镜分析细胞内的荧光信号。

3.6检测人D407细胞表达Mesdc2的mRNA水平(1) RNA提取：取10 cm2D407细胞加入1 mL TRIzol，倒入1.5 mL的Eppendorff管中，先后以氯仿、异丙醇、75%乙醇处理RNA样品后，加入20 μL的DEPC溶解，测定吸光度(A)值后，计算样品RNA浓度。 (2) 逆转录PCR：逆转录合成cDNA第1链，逆转录反应体系(12 μL)：1 μL引物，10 μL模板RNA，1 μL dNTP，2 μL DEPC，65 ℃ 5 min;再加入4 μL 5×first-strand buffer，2 μL 0.1 mol/L DTT，1 μL RNase inhibitor，42 ℃ 2 min;再加入1 μL SSIII逆转录酶，42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min。(3) PCR反应体系(20 μL)：GAPDH上游引物和下游引物各1 μL，人Mesdc2上游引物和下游引物各1 μL，5倍PCR缓冲液4 μL，TaKaRa EX TaqTMHS 0.4 μL，灭菌ddH2O 12.6 μL，逆转录产物 1 μL。PCR反应条件为:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环;4 ℃终止反应。人Mesdc2的上游引物序列为5’-ATGGCGGCTTCCAGGTGGGC-3’，下游引物序列为5’-ACTGCTGCCCCATCACAGGT-3’，扩增片段长度为716 bp；GAPDH作为内参照， 上游引物序列为5’- CTTCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游引物序列为5’-ATGAGGTCCACCACCCTGTTG-3’，扩增片段长度为681 bp。

3.7检测小鼠视网膜表达Mesdc2的mRNA水平(1) RNA提取：取2个小鼠视网膜加入1 mL TRIzol，研磨组织后倒入1.5 mL的Eppendorff管中，先后以氯仿、异丙醇、75%乙醇处理RNA样品后，加入20 μL的DEPC溶解。测定吸光度(A)值后，计算样品RNA浓度。 (2) 逆转录PCR:采用两步法进行逆转录PCR检测。逆转录合成cDNA第1链。逆转录反应体系：1 μL引物，8 μL模板RNA，1 μL dNTP，2 μL DEPC，65 ℃ 5 min；再加入4 μL 5× first-strand buffer, 2 μL 0.1 mol/L DTT，1 μL RNase inhibitor，1 μL SSIII逆转录酶，50 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。 (3) PCR反应体系(20 μL)：GAPDH上游引物和下游引物各1 μL，小鼠Mesdc2上游引物和下游引物各1 μL，5倍PCR缓冲液4 μL，TaKaRa EX TaqTMHS 0.4 μL，灭菌ddH2O 12.6 μL，逆转录产物1 μL。PCR反应条件为:94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环; 4 ℃终止反应。小鼠Mesdc2上游引物序列为5’-TCAGATCTATGGCGGACACTCCGGGCGAGG-3’，下游引物序列为5’-TTCTCGAGCTAAAGGTCTTCTCTTCTGCTCCC-3’，扩增片段长度为587 bp；GAPDH作为内参照， 上游引物序列为5’-GTGCAGCGAACTTTATTGATGG-3’，下游引物序列为5’-TGGTGAAGCAGGCATCTGAG-3’，扩增片段长度为403 bp。取5 μL扩增产物与1 μL 6倍的loading缓冲液混合后，加入1%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1倍Tris-硼酸-EDTA缓冲液，室温下恒定电压170 V，电泳30 min。使用BLS303PC凝胶自动成像系统记录。

3.8免疫印迹法检测Mesdc2的表达取牛POS及视网膜组织用RIPA裂解液裂解提取组织蛋白，并通过使用抗Mesdc2抗体和HRP标记的II抗进行Western blot分析。

3.9POS盘膜与Mesdc2的结合实验将HEK293细胞用Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG质粒转染48 h。用蛋白酶抑制剂通过3次冷冻-解冻得到细胞裂解物，随后在4 ℃下16 000×g离心30 min，将裂解液通过0.2微米的过滤器过滤。 4 ℃下POS盘膜(500 μg)与细胞裂解物共同孵育1 h，用PBS洗涤并离心5次。POS结合Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG用鼠抗FLAG单克隆抗体，然后Alex594羊抗鼠II抗，使用流式细胞术检测。

3.10D407细胞与Mesdc2结合实验4 ℃下D407与细胞裂解物共同孵育1 h，用PBS洗涤并离心5次。 D407细胞结合Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG用鼠抗FLAG单克隆抗体，然后Alex594羊抗鼠II抗，使用流式细胞术检测。

4统计学分析

使用统计软件SPSS 16.0行统计学分析。所有实验至少独立重复3次，数据按均数±标准误(mean±SEM)表示，组间两两比较使用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1Mesdc2在小鼠视网膜的表达

与巨噬细胞和小胶质细胞不同，RPE细胞是固定的吞噬细胞，因此Mesdc2在视网膜表达的位置非常重要，与其作为RPE细胞吞噬配体高度相关。我们首先通过RT-PCR验证其在视网膜中的表达。其次我们通过免疫印迹检测Mesdc2在视网膜和POS表达的量，我们在POS中没有检测到β-肌动蛋白，这可能与POS的特殊结构有关。我们进一步通过免疫组化检测Mesdc2在视网膜中的表达，抗Mesdc2和抗视紫红质抗体可以验证其在视网膜的表达，结果表明Mesdc2主要表达在POS层，与POS生物标志物视紫红质完全共定位，虽然视网膜各层均有表达，但表达量远少于POS层，表明Mesdc2集中表达在具有促进RPE细胞吞噬作用的有利表达部位，见图1。

Figure 1.The expression of Mesdc2 in mouse retina. A: Mesdc2 expression in mouse retina detected by RT-PCR; B: Mesdc2 expression in the bovine retina and POSs detected by Western blot; C: Mesdc2 and rhodopsin expression and co-localization in mouse retina detected by immunohistochemistry.

图1Mesdc2在小鼠视网膜中的表达分析

2Mesdc2促进D407细胞吞噬POS盘膜

pHrodo是pH敏感的荧光染料，从新鲜牛眼制备的POS用pHrodo标记后，在被吞噬成为酸性吞噬体后，其荧光强度明显增强[8]，结合共聚焦显微镜可明确区分摄入和未摄入的POS。同时使用流式细胞仪检测被吞噬的POS荧光信号。共聚焦显微镜结果表明，纯化的Mesdc2可刺激人D407 RPE细胞吞噬POS，pHrodo信号与亮视野显微镜图叠加图像清楚地显示，标记的POS被吞噬进D407细胞。加入Mesdc2的D407细胞吞噬POS明显多于MBP，差异具有统计学显著性(P<0.01)。同时我们做了浓度梯度的实验，发现D407细胞吞噬POS与Mesdc2的浓度呈现剂量依赖性，但在达到饱和浓度后其吞噬能力下降，而MBP不具有此特征，两者在50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L比较差异有统计学显著性，其中100 nmol/L 达到吞噬的峰值(P<0.01), 见图2。

3Mesdc2促进原代小鼠视网膜色素上皮细胞吞噬POS

我们使用新生小鼠眼球制备原代RPE细胞与Mesdc2蛋白及POS共同孵育，分析其促吞噬作用，MBP蛋白作为阴性对照。结果表明Mesdc2可诱导原代RPE细胞吞噬POS，而MBP没有诱导RPE细胞吞噬，两者比较差异有统计学显著性(P<0.01)。这些结果表明，人D407和原代小鼠RPE细胞具有相似的吞噬机制,见图3。

4Mesdc2能与POS和D407细胞结合

本实验将Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG细胞裂解物分别与脱落的POS盘膜及D407细胞一起孵育，通过流式细胞术证实Mesdc2-FLAG可结合至POS盘膜及D407细胞表面, GFP-FLAG作为阴性对照。在与POS盘膜的结合实验中，GFP为5.5%，Mesdc2为42.8%。在D407细胞的结合实验中，GFP为0.3%，Mesdc2为64.2%，差异均有统计学显著性,见图4。

5Mesdc2通过吞噬体介导内吞

我们使用吞噬体生物标志物Rab7来验证Mesdc2介导POS摄入是通过吞噬途径，在Mesdc2组，Rab7与摄入的POS共定位，MBP是阴性对照，因此Mesdc2介导的内化是通过靶向摄取POS到吞噬体的一个吞噬过程,见图5。

Figure 2.Mesdc2 stimulated the phagocytosis of D407 cells. A: the phagocytosis of pHrodo by D407 cells stimulated by Mesdc2, MBP was negative control; B: quantification of relative fluorescence intensity in D407 cell phagocytosis stimulated by Mesdc2 and MBP; C: quantification of relative fluorescence intensity in D407 cell dose-dependent phagocytosis stimulated by Mesdc2 and MBP. Mean±SEM.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsMBP.

图2Mesdc2促进D407细胞吞噬

Figure 3.Mesdc2 stimulated phagocytosis of mouse primary RPE cells. A: the phagocytosis of pHrodo by mouse primary RPE cells stimulated by Mesdc2, MBP was negative control; B: quantification of relative fluorescence intensity in mouse primary RPE cell phagocytosis stimulated by Mesdc2 and MBP. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsMBP.

图3Mesdc2促进小鼠原代视网膜色素上皮细胞吞噬

Figure 4. The binding of Mesdc2 with POS (A) and D407 cells (B) analyzed by flow cytometry. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsGFP-FLAG.

图4流式细胞术分析Mesdc2-FLAG与POS和D407细胞的结合情况

Figure 5. The co-localization of pHrodo and Rab7 in D407 cells observed by confocal microscopy. The pHrodo signal (red) co-loca-lized with Rab7 signal (green).

图5共聚焦显微镜下检测D407细胞摄入的POS与Rab7共定位

讨论

年龄相关性黄斑变性的一个显著特征是细胞内脂褐素和细胞外玻璃膜疣的沉积，随后出现RPE细胞的缺失、感光细胞的损伤及Bruch膜的改变、新生血管长入等病理改变。随着研究的深入, 人们逐渐认识到RPE细胞吞噬及降解POS功能的异常在AMD的发病中起着重要的作用[9]。在老年小鼠RPE中脂褐素的含量约为刚出生时的20倍，并且脂褐素的蓄积阻碍RPE吞噬POS盘膜[10]。还有研究发现, 未吞噬的POS碎片由RPE细胞顶端转移到RPE下，参与形成玻璃膜疣[11]。

Mesdc2是LRP家族的分子伴侣，可促进细胞表面LRP分子的折叠和表达。例如促进LRP1，2，4，5，6的表达[6]。敲除Mesdc2可导致LRP5/6的异常表达和胚胎极性的破坏[12-13]。LRP家族的内吞活性和信号转导是众所周知的。LRP1是一种多功能的清道夫受体[14]。LRP1有至少30个不同的配体，参与脂蛋白代谢和病毒及细菌毒素进入细胞。LRP5/6是Wnt信号通路的共同受体，参与内吞作用。

本实验证实了Mesdc2是一个新的RPE细胞的吞噬配体，它可能从脱落的POS盘膜中被释放，并与RPE细胞和POS盘膜表面受体结合，并将其连接后进行吞噬清除。Mesdc2在视网膜表达的位置非常重要，与其作为RPE细胞吞噬配体高度相关。本研究发现Mesdc2主要表达在POS层，其它视网膜层也存在低水平表达，虽然视网膜各层均有表达，但表达量远少于POS，表明Mesdc2集中表达在具有促进RPE细胞吞噬作用的有利表达部位。在感光细胞中，蛋白质主要在光感受器内节层合成，此处即是内质网[15]。成熟的蛋白质通过连接纤毛从内节层转运到POS层。虽然Mesdc2作为ER伴侣在无内质网的POS层高表达的分子机制还不清楚，但Mesdc2在POS的高表达提示了其可作为配体调节RPE细胞吞噬作用。

本实验通过人D407细胞和鼠原代RPE细胞验证了纯化的Mesdc2可刺激RPE细胞吞噬POS盘膜，pHrodo信号与亮视野显微镜图叠加图像清楚地显示，标记的POS被吞噬进D407细胞。加入Mesdc2的D407细胞吞噬POS盘膜明显多于MBP，差异具有统计学显著性，在浓度梯度的实验，Mesdc2在高浓度(200 nmol/L)刺激的RPE细胞吞噬作用的活性降低，可能在浓度过高时桥接分子效率降低。因此，这些结果支持Mesdc2是一个RPE细胞吞噬桥接分子。

一个蛋白质作为吞噬配体的标准是其可在胞外结合被吞噬体和受体。本实验通过流式细胞术证实Mesdc2-FLAG可结合至POS盘膜及D407细胞表面，与阴性对照组GFP-FLAG比较，差异明显，可见Mesdc2可在胞外结合至RPE细胞及POS表面，并促进吞噬，但在RPE细胞和POS的结合受体目前还有待鉴定。

虽然RPE细胞吞噬的分子机制并不明确，但本研究通过多方面的证据独立验证Mesdc2是RPE细胞的一个吞噬配体，其中包括其在POS的高表达，刺激诱导RPE细胞吞噬。Mesdc2作为一种新的RPE细胞吞噬配体将有助于深入了解RPE细胞吞噬的分子生物学机制。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Effect of Mesdc2 on phagocytosis of retinal pigment epithelial cells

CHEN Xiu-ping, YUAN Yuan-zhi, WANG Li-yang, YUAN Fei

(DepartmentofOphthalmology,ZhongshanHospitalofFudanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:yuan.fei@zs-hospital.sh.cn)

[KEY WORDS]Mesoderm development candidate 2; Phagocytosis; Retinal pigment epithelial cells

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of mesoderm development candidate 2 (Mesdc2) on phagocytosis of retinal pigment epithelial (RPE) cells. METHODS: The purified Mesdc2 protein was used to incubate with mouse primary RPE cells or D407 cells. The bound and ingested photoreceptor outer segments (POSs) by RPE cells were observed by confocal microscopy and flow cytometry. RESULTS: The Mesdc2 protein was expressed throughout the retina, and predominantly in POSs. Internalized POSs were co-localized with phagosome biomarker Rab7, suggesting that Mesdc2-mediated engulfment was involved in a phagocytosis pathway. Mesdc2 stimulated phagocytosis of POS vesicles by D407 RPE cells in a dose-dependent manner. The effect of Mesdc2 on phagocytosis decreased after the saturation concentration. Mesdc2 bound to both D407 RPE cells and shed POS vesicles. CONCLUSION: Mesdc2 stimulates the phagocytosis of retinal pigment epithelial cells.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1084- 07

[收稿日期]2015- 08- 03[修回日期] 2016- 03- 09

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81470637); 上海市科学技术委员会基金资助项目 (No. 13411950405)

通讯作者△Tel: 021-64041990-2671； E-mail: yuan.fei@zs-hospital.sh.cn

[中图分类号]R774; R363.2

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.021