1型糖尿病、2型糖尿病及2型糖尿病伴动脉硬化患者外周血白细胞端粒长度的研究*

王建飞，　董　旭，　张　毅，　曹　丽，　曹若琼，　孙阳阳，　王建国，　钟　理,3△，　王　君，　边志颖

(河北大学1生命科学学院生物芯片研究室，2附属医院，河北 保定 071002；3Western University of Health Science， Pomona, CA 91766， USA；4保定市第一中心医院内分泌3科，河北 保定 071002)



1型糖尿病、2型糖尿病及2型糖尿病伴动脉硬化患者外周血白细胞端粒长度的研究*

王建飞1，董旭1，张毅1，曹丽1，曹若琼1，孙阳阳1，王建国2，钟理1,3△，王君4△，边志颖4

(河北大学1生命科学学院生物芯片研究室，2附属医院，河北 保定 071002；3Western University of Health Science， Pomona, CA 91766， USA；4保定市第一中心医院内分泌3科，河北 保定 071002)

[摘要]目的： 检测1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、2型糖尿病伴动脉硬化(DAS)患者外周血白细胞端粒长度，分析糖尿病患者端粒长度变化的因素。方法：选择T1DM患者30例、T2DM患者60例、DAS患者40例和健康对照(NC组)40例，分别提取外周血白细胞，然后提取基因组DNA进行real-time PCR检测端粒长度。利用多元线性回归分析影响端粒长度变化的因素。结果：T1DM组、T2DM组和DAS组的端粒长度均小于NC组(P<0.05)；T1DM组端粒长度短于T2DM组和DAS组；DAS组较T2DM组更短。多元线性回归分析显示,T1DM组中，年龄与端粒长度呈负相关(P<0.05)；T2DM组中，年龄、体重指数(BMI)与端粒长度呈负相关(P<0.05)；DAS组中，患病时间、BMI与端粒长度呈负相关(P<0.05)。结论：糖尿病患者的外周血白细胞端粒长度明显短于正常人，并且T1DM患者端粒长度短于T2DM；在2型糖尿病的对比中，DAS患者的端粒长度明显短于T2DM。患者的年龄、患病时间、BMI与端粒长度的缩短有密切的关系。

[关键词]端粒长度； 糖尿病； 动脉硬化

端粒是由2位著名的遗传学家McClintock[1]与Muller[2]最早提出来的，他们发现染色体的稳定性和完整性是由染色体的末端来维持的，并且Muller[2]将其命名为“telomere”。端粒是非常特殊的DNA结构，位于真核细胞的染色体末端，是由上千段重复串联的DNA序列(TTAGGG)和蛋白质所构成的，具有保护DNA不被降解的作用，是DNA复制过程所必须的结构元件[3]。端粒与细胞分裂有密切的关系，随着细胞的分裂端粒长度在不断变短，当达到一定长度，也就宣告了细胞凋亡，因此，端粒长度常作为细胞衰老的生物学标志[4]。

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或二者兼有所引起的疾病，体内长期的高血糖会引起一系列的并发症，例如：心脏、血管、肾脏、眼等的损伤。本研究以1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)以及2型糖尿病伴动脉硬化(diabetes complicated with arterial sclerosis,DAS)患者为研究对象，探讨不同分型糖尿病及糖尿病并发症对端粒长度的影响；以及年龄、性别、体重指数(body mass index，BMI)、吸烟、患病时间等因素对糖尿病患者外周血白细胞端粒长度的影响。

材料和方法

1临床资料

收集2014年12月～2015年12月在保定市第一中心医院和河北大学附属医院130例糖尿病患者的外周血液样本。患者此前并没有接受或者很少接受系统的治疗。根据《内科学(第7版)》 中对于T1DM的诊断标准[5]，选择T1DM患者30例[包含8例T1DM亚型：成人隐匿性自身免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes in adults，LADA)]，为排除年龄干扰，选择患者均为成年人，其中男14例，女16例，年龄33～52岁；根据《2010中国糖尿病指南》中糖尿病诊断标准，选择T2DM患者60例，其中男28例，女32例，年龄25～69岁；选择DAS患者40例，其中男19例，女21例，年龄42～88岁；选取40名健康人作为正常对照(normal control，NC)组，其中男18例，女22例，年龄23～55岁。

2主要试剂与仪器

基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；2×SYBR Green qPCR Master Mix (DBI)；NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo)；CFX96 荧光定量PCR仪(Bio-Rad)。

3主要方法

3.1基因组DNA的提取采用血液基因组提取试剂盒提取基因组DNA，NanoDrop 2000c检测DNA的纯度和浓度，选择A260/A280值为1.80～2.00的DNA样本；将样本稀释成2.5 μg/L，-20 ℃保存备用。

3.2端粒长度检测运用端粒长度比值评估各组的端粒长度，端粒长度比值(T/S比值)即样本中端粒重复拷贝数(T)和单拷贝基因拷贝数(S)的比值，使用real-time PCR技术进行端粒长度的检测[6]。端粒基因的上游引物序列(Telomere-F)为 5’-CGGTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3’,下游引物序列(Telomere-R)为 5’-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3’;内参照基因上游引物序列(36B4-F)为 5’-CAGCAAGTGGGAA GGTGTAATCC-3’, 下游引物序列(36B4-R)为 5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’。 PCR 引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR的反应体系为2× SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL(引物浓度为 10 mmoL/L)，模板DNA 4 μL，超纯水5 μL，扩增体系总体积为20 μL。端粒与内参照基因的反应条件均为 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环;首循环95 ℃ 10 min，扩增反应的特异性使用熔解曲线检验。PCR产物进行4%的琼脂糖凝胶电泳，进一步验证产物特异性(图1)。实验中的每个样品均做3个平行，取平均值作为该样品的Ct值；精确计算样品端粒及内参照36B4基因的Ct值，T/S 比率同端粒长度呈正比例关系，端粒长度就可以根据T/S来测定。ΔCt=Cttelomere-Ct36B4，相对T/S比率=2-(ΔCt1-ΔCt2)=2-ΔΔCt，ΔCt1为每个样品T/S比率，ΔCt2为参考DNA的T/S比率。

Figure 1.PCR product of telomere and reference gene. M: marker; 1, 2: telomere; 3, 4: 36B4.

图1端粒与内参照基因PCR产物

4统计学处理

使用SPSS 19.0软件对实验数据进行分析，定量资料用均数±标准差(mean±SD)表示；不同组间采用方差分析F检验；对于端粒长度影响因素的分析采用多元线性回归，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

14组研究对象的基本资料

利用单因素方差分析对研究对象的基本资料进行两两比较(表1)。在4组比较中性别和吸烟的差异没有统计学显著性；而年龄、BMI和患病时间的差异有统计学显著性(P<0.05)。T1DM、T2DM和DAS的端粒长度均短于NC组，且差异有统计学显著性(P<0.05)；T1DM端粒长度较T2DM组和DAS组进一步缩短，DAS组端粒长度较T2DM组进一步缩短，但差异均无统计学显著性。

*P<0.05vsNC group.

2多元线性回归分析影响端粒长度的因素

以端粒长度为因变量，性别、年龄、BMI、患病时间和吸烟为自变量，建立多元线性回归。

2.1T1DM组多元线性回归分析对于T1DM组的分析结果显示，性别、患病时间、BMI、吸烟与患者端粒长度没有相关性；年龄与端粒长度呈负相关(P<0.05)，表明年龄越大，端粒长度越短，见表2。

2.2T2DM组多元线性回归分析对于T2DM组的分析结果显示，性别、患病时间、吸烟与患者端粒长度没有相关性；年龄、BMI与端粒长度呈负相关(P<0.05)，表明年龄越大、BMI值越大，端粒长度越短，见表3。

2.3DAS组多元线性回归分析对于DAS组的分析结果显示，年龄、性别、吸烟与患者端粒长度没有相关性；患病时间、BMI与端粒长度呈负相关(P<0.05)，表明患病时间越长、BMI值越大，端粒长度越短，见表4。

讨论

近年来，越来越多的科学家发现糖尿病、心脏病、动脉硬化等慢性疾病会影响端粒长度的变化[7-9]，并在2型糖尿病患者中发现存在端粒缩短的现象[10]，且在动脉硬化等血管病变的患者中也发现了端粒缩短的现象[9, 11-12]。随着年龄的增长，糖尿病的发病风险有所提高[13]，是由于年龄的增长会导致胰岛素分泌量降低；而且随着年龄增长，端粒长度也会随之缩短[4]。

本研究发现，T1DM组端粒长度短于T2DM组，2组的多元线性回归分析表明年龄为影响二者端粒减短的原因，而BMI会影响T2DM组的端粒长度。这可能是二者的发病原因不同所致。T1DM为T细胞相关联的自身免疫性疾病，主要发生在青少年中，可以通过抗体检测进行诊断，并且经常伴有酮症酸中毒现象[14]。T1DM对胰岛素多种抗原成分免疫欠耐受，因此导致了针对胰腺B细胞的自身免疫性破坏，当出现糖尿病症状的时候，80%的胰岛β细胞已经遭到严重破坏[15]。de Magalhães等[16]也发现自身免疫与端粒长度存在比较密切的联系，当端粒缩短之后又会对胰岛细胞进行进一步损伤。所以T1DM是非常严重的糖尿病类型，对其进行早期的诊断治疗是非常必要的。T2DM是由于胰岛素抵抗或者胰岛素缺少而发生的代谢性疾病，多发生于成年人，T2DM的端粒长度缩短可能是由于氧化应激反应所致[17]，因为端粒富含的鸟嘌呤极易受到氧化应激反应的影响而导致端粒长度的缩短[18-19]；而肥胖也是T2DM的标志之一，本研究的多元线性分析也表明BMI的增大会导致端粒的缩短，有研究表明，肥胖也是会增加体内的氧化应激程度[19]，导致胰岛细胞的破坏，产生或加重糖尿病病情。

本研究发现，2型糖尿病当患有动脉硬化并发症时，端粒长度会比无并发症的2型糖尿病患者的端粒长度要更短，但是仍然长于1型糖尿病患者，表明大血管并发症会使端粒进一步缩短。通过多元线性回归分析发现：患病时间与BMI会影响患者的端粒长度，通过表1也看出DAS的患病时间要长于T2DM，随着糖尿病的病情发展就会出现一些并发症而严重影响人类的身体健康情况。研究表明，细胞老化是动脉硬化的危险因素，细胞的衰老会促进血管内皮的损伤和动脉血栓的形成[20]；糖尿病对细胞端粒的损伤会加速细胞的老化以至于促进动脉硬化的形成而危及病人生命。

综上所述，本实验以本地区、同等条件下的T1DM、T2DM与DAS患者进行外周血白细胞的端粒长度检测，3组患者的外周血白细胞端粒长度均短于正常人，而T1DM组的最短，表明T1DM对人体伤害更为严重；患有并发症时，患者的端粒长度会进一步缩短，表明糖尿病并发症对患者的伤害非常大，严重影响了患者的生命。由于糖尿病会影响外周血白细胞端粒长度变化，那么端粒长度可能会成为糖尿病诊断、判断病情程度的重要分子指标。在以后的研究中，对糖尿病其它并发症进行系统的研究，并且加强对糖尿病患者的跟踪治疗与检测，进行治疗前后的端粒长度统计，能够系统完善地研究糖尿病对患者端粒长度的影响。希望端粒长度的变化能够作为检测病情发展，并发症早期诊断与预防的重要分子指标，在以后的糖尿病治疗与研究中能起到重要作用。

[参考文献]

[1]McClintock B. The stability of broken end of chromosome inZeamays[J]. Genetics, 1941, 26(2): 234-282.

[2]Muller HJ. The remaking of chromosomes[J]. Collecting Net, 1938, 13(8): 181-198.

[3]Blackburn EH. Structure and function of telomeres[J]. Nature, 1991, 350(6319): 569-573.

[4]Zakian VA. Structure, function, and replication ofSaccharomycescerevisiaetelomeres[J]. Annu Rev Genet, 1996, 30:141-172.

[5]程桦.糖尿病[M]// 陆再英， 钟南山. 内科学.第7版. 北京: 人民卫生出版社, 2009：644-665.

[6]Yang Z, Huang X, Jiang H, et al. Short telomeres and prognosis of hypertension in a Chinese population[J]. Hypertension, 2009, 53(4): 639-645.

[7]Jeanclos E, Krolewski A, Skurnick J, et al. Shortened telomere length in white blood cells of patients with IDDM[J]. Diabetes, 1998, 47(3):482-486.

[8]Elks CE, Scott RA. The long and short of telomere length and diabetes[J]. Diabetes, 2014, 63(1):65-67.

[9]Salpea KD, Humphries SE. Telomere length in atherosclerosis and diabetes[J]. Atherosclerosis, 2010, 209(1):35-38.

[10]Liu Z, Zhang J, Yan J, et al. Leucocyte telomere shortening in relation to newly diagnosed type 2 diabetic patients with depression[J]. Oxid Med Cell Longev, 2014, 2014:673959.

[11]Matthews C, Gorenne I, Scott S, et al. Vascular smooth muscle cells undergo telomere-based senescence in human atherosclerosis: effects of telomerase and oxidative stress[J]. Circ Res, 2006, 99(2):156-164.

[12]Okuda K, Khan MY, Skurnick J, et al. Telomere attrition of the human abdominal aorta: relationships with age and atherosclerosis[J]. Atherosclerosis, 2000, 152(2):391-398.

[13]Mulder H, Ling C. Mitochondrial dysfunction in pancreatic beta-cells in type 2 diabetes[J]. Mol Cell Endocrinol, 2009, 297(1-2):34-40.

[14]Jefferies C, Cutfield S, Derraik JG, et al. 15-year incidence of new-onset diabetic ketoacidosis in children with type 1 diabetes from a regional paediatric setting (Auckland, New Zealand)[J]. Int J Pediatr Endocrinol, 2015, 2015(Suppl 1): P3.

[15]Knip M, Siljander H. Autoimmune mechanisms in type 1 diabetes[J]. Autoimmun Rev, 2008, 7(7):550-557.

[16] de Magalhães JP. From cells to ageing: a review of models and mechanisms of cellular senescence and their impact on human ageing[J]. Exp Cell Res, 2004, 300(1):1-10.

[17]Sampson MJ, Winterbone MS, Hughes JC, et al. Monocyte telomere shortening and oxidative DNA damage in type 2 diabetes[J]. Diabetes Care, 2006, 29(2): 283-289.

[18]Dabelea D, Harrod CS. Role of developmental overnutrition in pediatric obesity and type 2 diabetes[J]. Nutr Rev, 2013, 71(10):S62-S67.

[19]Jonas JC, Bensellam M, Duprez J, et al. Glucose regulation of islet stress responses and β-cell failure in type 2 diabetes[J]. Diabetes Obes Metab, 2009, 11(4):65-81.

[20]Comi P, Chiaramonte R, Maier JA. Senescence-dependent regulation of type 1 plasminogen activator inhibitor in human vascular endothelial cells[J]. Exp Cell Res, 1995, 219(1):304-308.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Telomere length in peripheral blood leukocytes of T1DM, T2DM and DAS patients

WANG Jian-fei1, DONG Xu1, ZHANG Yi1, CAO Li1, CAO Ruo-qiong1, SUN Yang-yang1, WANG Jian-guo2, ZHONG Li1,3, WANG Jun4, BIAN Zhi-ying4

(1LaboratoryofBiochip,CollegeofLifeSciences，2AffiliatedHospital,HebeiUniversity,Baoding071002,China;3WesternUniversityofHealthScience,Pomona,CA91766,USA;4ThirdDepartmentofEndocrinology,BaodingFirstCentralHospital,Baoding071002,China.E-mail:lee_z@yahoo.com;ztywj5109@163.com)

[KEY WORDS]Telomere length; Diabetes mellitus; Arterial sclerosis

[ABSTRACT]AIM: To test the telomere length of peripheral blood leukocytes in the patients with type 1 diabetes mellitus (T1DM), type 2 diabetes mellitus (T2DM) and T2DM complicated with arterial sclerosis (DAS), and to explore the related mechanism. METHODS: Thirty patients with T1DM, 60 patients with T2DM, 40 patients with DAS and 40 normal controls (NC group) were enrolled in this trial and the peripheral blood leukocytes were isolated to extract DNA for determining telomere length by real-time PCR. Multiple linear regression analysis was performed to analyze the factors changing telomere length. RESULTS: The telomere lengths in T1DM group, T2DM group and DAS group were less than that in NC group (P<0.05), that in T1DM group was shorter than those in T2DM group and DAS group, and that in DAS group was shorter than that in T2DM group. The results of multivariate linear regression analysis showed that age was negatively correlated with telomere length (P<0.05) in T1DM group, age and body mass index (BMI) were negatively correlated with telomere length (P<0.05) in T2DM group, and duration of illness and BMI were negatively correlated with telomere length (P<0.05) in DAS group. CONCLUSION: The telomere length of peripheral blood leukocytes in diabetic patients is shorter than that in normal people, and the telomere length of T1DM patients is shorter than those of T2DM and DAS patients. The telomere length of DAS patients is shorter than that of T2DM patients. The telomere length shortening in diabetic patients is mainly associated with age, duration of illness, and BMI.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1066- 05

[收稿日期]2015- 12- 14[修回日期] 2016- 01- 20

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81272444; No. 81472744)

通讯作者△钟理 Tel: 0312-5079365; E-mail: lee_z@yahoo.com；王君 Tel: 0312-5976756; E-mail: ztywj5109@163.com

[中图分类号]R587.1; R363.2

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.018