白藜芦醇对氧化应激诱导的大鼠海马神经元损伤的影响*

任应国，　唐石磊，　高园林

(1南阳市中心医院神经内科，河南 南阳 473000；2河南大学淮河医院神经外科，3开封市中心医院神经内科，河南 开封 475000)



白藜芦醇对氧化应激诱导的大鼠海马神经元损伤的影响*

任应国1，唐石磊2△，高园林3

(1南阳市中心医院神经内科，河南 南阳 473000；2河南大学淮河医院神经外科，3开封市中心医院神经内科，河南 开封 475000)

[摘要]目的： 研究不同剂量的白藜芦醇对大鼠海马神经元氧化损伤的影响。 方法: 通过体外原代培养获得大鼠海马神经元。实验分为对照(control，Con)组、三甲基氯化锡(trimethyltin chloride，TMT)组、溶剂对照(vehicle)组和白藜芦醇(resveratrol，Res)组。其中，Res设4个浓度：5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L；除对照组外，其它各组细胞均采用三甲基氯化锡(TMT)处理使细胞出现氧化应激状态。采用CCK-8法和荧光探针DCFH-DA法观察各组神经元的活力与细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的变化；TUNEL荧光染色法检测各组神经元的凋亡程度。结果: 与TMT组相比，不同浓度的白藜芦醇均能提高神经元的活力，其中20 μmol/L的作用最显著。20 μmol/L白藜芦醇能抑制经TMT处理后神经元内的ROS水平以及凋亡程度的增加。结论: 白藜芦醇具有抑制TMT诱导的大鼠海马神经元氧化损伤的作用。

[关键词]白藜芦醇； 海马神经元； 氧化应激； 三甲基氯化锡

氧化应激主要指体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生与清除发生失衡，从而导致细胞和组织受到氧化损伤。医学研究普遍认为氧化应激在神经退行性疾病的发生与发展过程中具有重要作用，如阿兹海默症、帕金森症、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩等疾病的发生均与氧化应激密切相关[1-2]。

白藜芦醇(resveratrol，Res)主要是葡萄、浆果和花生等多种植物在遇到恶劣环境中产生的一种天然的植物抗毒素，能够调节多种细胞生长进程，并具有保护细胞与抗氧化的功效[3]。研究表明，白藜芦醇能够激活Neuro2a细胞中腺苷酸活化蛋白激酶并促进轴突的生长，可能对以轴突病变和神经退行性变为主的疾病具有治疗作用[4-5]。三甲基氯化锡(trimethyltin chloride，TMT)是用于PVC塑料的稳定剂和防锈油漆的添加剂，可导致海马神经元退行性变，其主要机制是通过诱发神经元内聚集大量的活性氧自由基，从而导致神经元的病变。本实验采用TMT处理诱发海马神经元氧化应激模型，观察白藜芦醇对海马神经元氧化应激的保护作用，为白藜芦醇用于临床防治氧化应激相关的神经退行性疾病提供实验依据。

材料和方法

1主要仪器设备

超净工作台(苏州医疗设备厂)；CO2培养箱(Forma Scientific)；荧光倒置相差显微镜(Leica)；高速冷冻离心机(Biofugeprimor)。

2动物及主要试剂

Sprague-Dawley大鼠(山东大学实验动物中心)；白藜芦醇，纯度>98%(天津尖峰生物科技有限公司)；三甲基氯化锡(trimethyltin-chloride，TMT)、β-tubulin抗体(Sigma)；Triton X-100(上海索莱宝生物科技有限公司)；CKK-8试剂(Dojindo)；DCFH-DA活性氧检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；TUNEL试剂盒(Roche)；DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基(Gibco)；Hoechst 33258染色液(上海碧云天生物技术有限公司)。

3方法

3.1大鼠海马神经元的原代培养取新出生的SD大鼠，断头，剥离大脑，清洗2次。置于平皿中在解剖显微镜下分离出海马组织，剪碎为1 mm×1 mm×1 mm小块，加入0.125%胰酶2 mL，37 ℃消化25 min，消化结束后离心，弃去上清液，加入DMEM/F12培养基，反复吹打，静置液体后收集上清。重复上述步骤直至全部消化完全，收集上清，用200目细胞筛过滤制成单细胞悬液。细胞计数后，以2×108/L接种于培养瓶中，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，24 h后更换为Neurobasal培养基，继续培养，每隔2 d换全新培养基，培养7 d后用于后续实验。

3.2免疫荧光染色法鉴定神经元收集上述培养7 d后的神经元，PBS洗涤，加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3次，每次5 min。加入1% H2O2室温作用10 min，再加入0.3% Triton X-100室温透膜15 min。封闭液封闭1 h，加入β-tubulin III抗体(1∶50)，4 ℃过夜；再加入 II 抗(1∶200)避光孵育1 h。用染色液染色3 min，抗荧光淬灭封片液封片，于荧光显微镜下观察拍照。

3.3药物处理与分组将白藜芦醇溶解于0.24%四氢呋喃甲醇中，神经元培养7 d后，洗去培养基，分为：对照(control,Con)组;TMT组;溶剂对照组(vehicle组)：加入同等剂量四氢呋喃甲醇，再加入5 μmol/L TMT处理24 h；Res组：分别加入5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L白藜芦醇5 h后，再加入5 μmol/L TMT处理24 h。

3.4细胞活力的检测将经相应处理的各组神经元以2×108/L接种于96孔板中，每组设空白对照孔2个，只加入培养基。于各孔中加入10 μL的CCK-8试剂，在37 ℃避光孵育2 h。酶标仪在450 nm波长处测定各孔吸光度(A)值。孔读数=实测值-空白对照孔读数。

3.5ROS的检测采用DCFH-DA活性氧检测试剂盒来测定各组神经元内ROS水平。将各组神经元以2×108/L接种于48孔板中，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，24 h后更换为Neurobasal培养基，每孔100 μL，经相应处理后，按照试剂盒说明书操作进行处理，用酶标仪检测荧光强度488/525 nm下的荧光强度。

3.6神经元凋亡的检测将神经元以2×108/L接种于铺有盖玻片的48孔板中，每孔加入4%多聚甲醛，固定20 min，加入1% H2O2室温作用10 min，再加入0.3% Triton X-100冰上透膜15 min，PBS洗涤后，滴加TUNEL染色液20 μL，室温孵育90 min，Hoechst 33258染色5 min，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜观察并拍照。

4统计学处理

所有数据采用SPSS 15.0软件进行分析，实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示，各组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，Bonferroni校正的t检验进行多重比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1大鼠海马神经元的鉴定

检测β-tubulin III神经元特异性标志物并进行Hoechst 33258细胞核染色，如图1所示，绿色荧光为神经元染色，蓝色荧光为细胞核染色，神经元突起相互连接成网状，分布均匀，仅有少量细胞未出现绿色荧光，表明神经元的纯度高。

Figure 1. Identification of primary rat hippocampal neurons (×400). A: Hoechst 33258 nuclear staining; B: β-tubulin III neuron staining; C: overlapping.

图1原代大鼠海马神经元的鉴定

2各组神经元活力的比较

采用CCK-8法检测经不同浓度白藜芦醇预处理5 h、再经TMT诱导神经元损伤后细胞活力的变化。如图2所示，经TMT处理后，TMT组与vehicle组的细胞活力显著低于Con组(P<0.05)；与TMT组相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L的白藜芦醇均可提高神经元活力，差异有统计学显著性(P<0.05)。TMT组与vehicle组相比差异无统计学显著性。

Figure 2.The effects of resveratrol at different concentrations on the cell viability after oxidative stress injury. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsTMT group.

图2不同浓度白藜芦醇对诱导氧化应激神经元活力的影响

5 μmol/L和10 μmol/L白藜芦醇提高神经元活力作用的差距不大，20 μmol/L提高细胞活力作用适中，便于进行后续实验。选用20 μmol/L的白藜芦醇预处理神经元5 h后，加入TMT处理12 h、24 h和36 h;其中TMT处理24 h，白藜芦醇提高细胞活力的作用最显著，见图3。

3各组大鼠神经元ROS累积的比较

采用DCFH-DA荧光探针检测20 μmol/L白藜芦醇对神经元氧化应激诱导损伤后细胞ROS量的变化。与Con组相比，TMT组与vehicle组经TMT处理后神经元内的ROS水平显著增加(P<0.05)；TMT组与vehicle组间差异无统计学显著性；加入白藜芦醇预处理后，可显著抑制神经元内ROS的生成，见图4。

Figure 3. The effects of resveratrol at 20 μmol/L on the cell viability after oxidative stress injury. Mean±SD.n=3.

图320 μmol/L白藜芦醇预处理后对大鼠神经元氧化诱导不同时间细胞活力的影响

Figure 4. The effects of resveratrol at 20 μmol/L on the content of ROS after oxidative stress injury. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsTMT group.

图4白藜芦醇对诱导氧化应激后神经元内ROS含量的影响

4TUNEL荧光染色法

TUNEL荧光染色的阳性细胞呈绿色，细胞核被Hoechst 33258染成蓝色。如图5所示，Con组只有少量细胞呈阳性，推测为细胞的基础正常凋亡；TMT组与vehicle组可见大量呈阳性的细胞，提示TMT诱导氧化应激引起大量大鼠神经元的凋亡；加入20 μmol/L白藜芦醇预处理5 h后，可观察到呈阳性的细胞数量显著减少(P<0.05)，提示白藜芦醇可抵抗TMT对大鼠神经元的氧化应激作用。

Figure 5. The effects of resveratrol at 20 μmol/L on the cell apoptosis after oxidative stress injury (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsTMT group.

图5白藜芦醇对诱导氧化应激后大鼠神经元凋亡的影响

讨论

活性氧自由基累积导致的细胞氧化应激是神经退行性疾病发生的主要因素之一，因此如何清除细胞内活性氧以及进行细胞的氧化损伤修复成为预防和治疗神经退行性疾病的主要研究方向。白藜芦醇在抗菌、抗氧化和应激反应过程中起着重要作用。国外学者发现在多种组织器官随衰老出现氧化性损伤的小鼠模型中，白藜芦醇能够降低衰老引起的氧化损伤作用[6]。此外，白藜芦醇可以通过一氧化氮和内皮细胞一氧化氮合酶作用，对心血管系统产生影响，通过提高心肌线粒体锰超氧化物歧化酶的活性，从而增加呼吸链酶CoIV的活性[7]。Siddiqui等[8]研究发现白藜芦醇对氧化损伤的PC12细胞具有保护作用，能够显著降低细胞内活性氧自由基，并回复细胞内的GSH和脂质过氧化水平。有研究表明白藜芦醇的抗氧化作用可能与对羟基的直接歧化作用有关[9]。

白藜芦醇是近年来在氧化应激方面的研究热点，临床研究表明白藜芦醇对心脏、肝脏和肾脏具有显著的抗氧化作用，修复相应功能的损伤。Sun等[10]研究发现白藜芦醇具有抑制自由基反应，从而保护嗜酒者脑损伤后神经细胞的基本功能。杨迎暴等[11]报道指出白藜芦醇能够有效抑制急性脊髓损伤早期脂质过氧化反应以及活性氧的水平，具有保护脊髓损伤的作用。

我们研究发现，白藜芦醇可呈浓度依赖性地抑制TMT对海马神经元活力的损害，增加大鼠神经元的活力，具有量效关系。5 μmol/L和10 μmol/L浓度水平的白藜芦醇提高神经元活力作用的差距不大，20 μmol/L提高细胞活力作用更适用于进行后续实验。20 μmol/L水平的白藜芦醇能够显著降低氧化应激损伤的神经元中活性氧自由基的量，提示白藜芦醇对大鼠神经元具有保护作用。再者，白藜芦醇显著减少氧化应激损伤细胞的凋亡数，推测白藜芦醇具有抗氧化的保护作用，防止细胞的衰老凋亡。其具体机制将在后续实验中继续进行研究。

[参考文献]

[1]Fanelli F, Sepe S, D’Amelio M, et al. Age-dependent roles of peroxisomes in the hippocampus of a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Mol Neurodegener, 2013, 8:8.

[2]Fiorini A, Koudriavtseva T, Bucaj E. Involvement of oxidative stress in occurrence of relapses in multiple sclerosis: the spectrum of oxidatively modified serum protein deteceted by proteomics and redox proteomics analysis[J]. PLoS One, 2013, 8(6):e65184.

[3]Smoliga JM, Baur JA, Hausenblas HA. Resveratrol and health: a comprehensive review of human clinical trials[J]. Mol Nutr Food Res, 2011, 55(8):1129-1141.

[4]Dasgupta B, Milbrandt J. Resveratrol stimulates AMP kinase activity in neurons[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(7):7217-7222.

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[7]夏立志，胡秋玲. 白藜芦醇对老年大鼠心肌细胞线粒体细胞色素C氧化酶表达的影响[J]. 中国老年学杂志，2012, 3(13):2771-2772.

[8]Siddiqui MA, Kashyap MP, Kumar V, et al. Protective potential of trans-resveratrol against 4-hydroxynonenal induced damage in PC12 cells[J]. Toxicol In Vitro, 2010, 24(6):1592-1598.

[9]Camont L, Collin F, Couturier M, et al. Radical-induced oxidation oftrans-reveratrol[J]. Biochimie, 2012, 94(3):741-747.

[10]Sun NY, Sun GY. Ethanol and oxidative mechanisms in the brain[J]. J Biomed Sci, 2001, 8(1):37-43

[11]杨迎暴，朴英杰. 白藜芦醇对急性脊髓损伤早期脂质过氧化反应和活性氧水平的抑制作用[J]. 中国临床药理学与治疗学，2002, 7(2):193-196.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effects of resveratrol on oxidative damage induced by reactive oxygen series in rat hippocampal neurons

REN Ying-guo1, TANG Shi-lei2, GAO Yuan-lin3

(1DepartmentofNeurology,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,China.2DepartmentofNeurosurgery,HuaiheHospitalofHenanUniversity,3DepartmentofNeurology,KaifengCenterHospital,Kaifeng475000,China.E-mail:tangyong197102@126.com)

[KEY WORDS]Resveratrol; Hippocampal neurons; Oxidative stress; Trimethyltin chloride

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effects of resveratrol on oxidative damage in the rat hippocampal neurons. METHODS: The primary rat hippocampal neurons were isolated and culturedinvitro, and were treated with different concentrations of resveratrol (5, 10, 20 and 40 μmol/L) in the presence of trimethyltin chloride (TMT). Tetrahydrofuryl alcohol was used as a vehicle control. The cell viability was examined by CCK-8 assay. The generation of reactive oxygen species (ROS) was determined by DCFH-DA staining. The apoptosis of the neurons was detected by TUNEL. RESULTS: Compared with TMT group, resveratrol significantly reversed the decrease in the cell viability. The viability of the neurons reached the maximum level under the condition of resveratrol treatment at 20 μmol/L. Treatment with 20 μmol/L resveratrol inhibited TMT-induced increases in ROS generation and apoptosis in the neurons. CONCLUSION: Resveratrol attenuates TMT-induced oxidative damage in rat hippocampal neurons.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1057- 05

[收稿日期]2015- 10- 28[修回日期] 2016- 03- 11

*[基金项目]河南省科技厅资助项目(No. 102300410136)

通讯作者△Tel: 0371-23906045; E-mail： tangyong197102@126.com

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.016