叶黄素抑制叔丁基过氧化氢诱导的视网膜神经节细胞凋亡*

张婵娟，　赵佳仪，　黄翠芹，　李　勤，　王　珍，　甘丹卉，　朱丽红，　陆大祥△

(1暨南大学医学院病理生理学系，国家中药管理局三级科研实验室，广东 广州 510632；2安徽人口职业学院护理系，安徽 池州 247099)



▲并列第1作者

叶黄素抑制叔丁基过氧化氢诱导的视网膜神经节细胞凋亡*

张婵娟1,2▲，赵佳仪1▲，黄翠芹1，李勤1，王珍1，甘丹卉1，朱丽红1，陆大祥1△

(1暨南大学医学院病理生理学系，国家中药管理局三级科研实验室，广东 广州 510632；2安徽人口职业学院护理系，安徽 池州 247099)

[摘要]目的： 观察叶黄素(lutein)对叔丁基过氧化氢(t-BHP)处理的视网膜神经节细胞(RGC-5细胞系)的保护效应并探讨其作用机制。方法:用免疫荧光染色检测视网膜神经节特异性蛋白Brn-3和神经微管结合蛋白MAP-2的表达来鉴定RGC-5 细胞；将RGC-5细胞随机分为对照组、t-BHP处理组、t-BHP和lutein共同处理组、lutein处理组，培养24 h，MTT实验检测细胞活力；Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡；免疫细胞化学技术检测caspase-3蛋白的活化情况；Western blot检测Bcl-2/Bax、cleaved caspase-3、JNK和c-Jun蛋白的变化。结果： MTT实验和流式细胞检测结果显示，lutein能提高t-BHP处理的RGC-5 细胞的活力，并降低t-BHP诱导的RGC-5 细胞凋亡；免疫荧光结果显示lutein能抑制t-BHP诱导的caspase-3的活化；与对照组比较，t-BHP处理后RGC-5细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.05)，Bax/Bcl-2比率升高，cleaved caspase-3表达上调(P<0.05)，JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平增加(P<0.05)，t-BHP的上述作用可被lutein部分逆转。结论：Lutein能够降低t-BHP诱导的RGC-5细胞凋亡，其机制与其上调Bcl-2的表达、抑制caspase-3的活化并降低JNK和c-Jun蛋白的磷酸化有关。

[关键词]叔丁基过氧化氢； 叶黄素； RGC-5细胞系； 细胞凋亡

天然的叶黄素(lutein)是一种优能抗氧化剂，同时还具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等作用[1]；叶黄素还是视网膜黄斑的主要色素成份。研究证实叶黄素在对抗多种视觉疾病中发挥作用，如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)[2]、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, RP)[3]、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)[4]和视网膜缺血再灌注损伤[5]等，其研究多集中于对视网膜色素上皮细胞的保护方面[6-8]，神经营养作用[1,9]、抗炎作用[6,10]、减少蓝光和紫外线诱导的DNA损伤作用[11-12]以及减少细胞ROS含量[13]等有关。其对视网膜神经节的保护作用虽有报道，但作用机制仍待进一步探讨[14]。本文运用细胞培养及分子生物学技术，体外观察叶黄素对视网膜神经节细胞系RGC-5细胞是否具有保护作用，并对其机制进行探讨。

材料和方法

1细胞

RGC-5细胞系由上海复旦细胞库提供，其表达视网膜神经节细胞特异性蛋白Brn-3和神经微管结合蛋白MAP-2(microtubule-associated protein 2)。

2主要试剂

叶黄素和叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)购自上海阿拉丁试剂公司，DMEM/F12 试剂培养基购自HyClone，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自BI，胰蛋白酶和MTT购自Sigma，cleaved caspase-3 抗体、JNK抗体、c-Jun抗体、Bcl-2 抗体以及Bax抗体均购自Cell Signaling Technology，神经微管结合蛋白-2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)抗体购自Millipore，视网膜神经节细胞特异性蛋白Brn-3抗体购自Santa Cruz，Trict标记山羊抗兔、Dilight488 标记驴抗山羊Ⅱ抗购自Earthox。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3主要方法

3.1RGC-5 细胞株培养和传代常规消毒灭菌，用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基常规培养细胞，当细胞生长融合达70%～80%时进行传代，吸出原培养液，用PBS缓冲液漂洗细胞，去除细胞表面的培养基成分及衰老死亡的细胞碎片，然后吸出PBS加入适量的胰蛋白酶(消化液能覆盖细胞培养瓶或培养板底即可)，37 ℃消化，边消化边观察细胞形态，约3 min 后，倒置显微镜下观察细胞形态变化，见细胞变圆，细胞神经纤维消失，轻轻晃动有细胞从培养瓶或培养板底部脱落时，立即滴加含血清的培养基终止消化，反复轻柔吹打后收集细胞悬液，1 000 r/min离心3 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的完全培养基重悬单细胞悬液，计数，以密度4×107cells/L接种于新的培养瓶，37 ℃、5% CO2细胞培养箱内继续培养。

3.2RGC-5 细胞系鉴定将RGC-5 细胞以每孔2×104cells的密度接种于铺有直径为13 mm盖玻片的24孔板中，待细胞贴壁，显微镜下观察其状态良好时，去上清，复温 PBS 洗3次，每次5 min；复温4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次10 min；封闭液常温封闭1 h，弃封闭液；用抗体稀释液稀释至工作浓度的Ⅰ抗Brn-3(1∶100)和MAP-2(1∶100)，4 ℃ 湿盒分别孵育48 h和24 h，去除Ⅰ抗，PBS洗3次，每次10 min；用相应的荧光Ⅱ抗室温孵育Brn-3(4 h)，MAP-2(1 h)，去除Ⅱ抗，滴加Hoechst 33342试剂，室温10 min，PBS 洗3次，每次10 min；抗荧光封片剂封片后，Leica荧光显微镜下观察结果并拍照。

3.3实验分组(1)对照(control)组:加入完全培养基;(2)t-BHP处理组：加入终浓度为15 μmol/L t-BHP作用RGC-5 细胞24 h；(3)t-BHP和lutein共同处理组：加入15 μmol/L t-BHP、同时加入20 μmol/L lutein共同作用RGC-5 细胞24 h；(4)lutein处理组：加入终浓度为20 μmol/L lutein单独作用RGC-5 细胞24 h。

3.4MTT比色法检测细胞活力将RGC-5细胞以每孔8×103cells的密度接种于96孔板中，待细胞生长12 h，用不同浓度t-BHP 与lutein对细胞处理，每组设6个复孔，24 h 后，用终浓度为5 g/L的MTT溶液与无血清DMEM/F12配置成含10% MTT的混合液，去除原培养液，每孔加入100 μL MTT混合液(上述配液及加液过程需避光操作)后置培养箱中37 ℃孵育4 h，弃上清，加入150 μL DMSO在预热10 min 的Bio-Rad酶标仪570 nm 波长处测定各孔吸光度(A)值,评价细胞活力，实验重复3次。

3.5Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡将RGC-5 细胞以每孔3×105cells的密度接种于6孔板中培养12 h后换液分组加药作用24 h，收集细胞，包括漂浮在培养基上的细胞，1 000 r/min离心5 min，用PBS将EDTA洗去，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入PBS重悬，分出200 μL正常细胞不染色；1 000 r/min离心5 min,弃上清，加入200 μL Binding Buffer重悬，混匀后，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC，室温避光孵育10 min染色，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL Binding Buffer重悬，混匀后，加入5 μL PI染色，上机检测各组细胞的凋亡率。实验重复4次。

3.6免疫细胞化学染色将RGC-5细胞以每孔2×104cells的密度接种于铺有直径为13 mm盖玻片的24孔板中培养12 h，换液分组加药，作用24 h，弃上清，用复温PBS洗3次，每次5 min，后用复温4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3次，每次10 min，然后用封闭液常温封闭1 h，弃封闭液，加入用抗体稀释液稀释至工作浓度的Ⅰ抗cleaved caspase-3(1∶250)，4 ℃湿盒过夜，去除Ⅰ抗，PBS洗3次，每次10 min，相应荧光Ⅱ抗室温孵育2 h，去除Ⅱ抗，滴加Hoechst 33342试剂，室温10 min，PBS洗3次，每次10 min，抗荧光封片剂封片后，Leica荧光显微镜下观察结果并拍照。实验重复3次。

3.7Western blot将RGC-5细胞以每孔5×105cells的密度接种于6 cm的皿中，12 h后，换液分组加药，24 h后，弃去各组培养液, 每皿加入80 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min，每隔10 min用细胞刮刮1次细胞，使裂解液与细胞充分混匀，用EP管收集上述混合液，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，吸取上清；用BCA定量试剂盒(碧云天)进行蛋白定量，加入相应的loading buffer后，100 ℃变性5 min，分装后放入-80 ℃冰箱备用；取上述样品，按每组40 μg上样，以12%～15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其中浓缩胶60 V 30 min，分离胶120 V 60 min；湿转法转移至PVDF膜，250 mA 90 min，电转结束后取出PVDF膜用PBST洗3次，每次5 min，5%脱脂奶粉室温孵育PVDF膜2 h，PBST洗3次，每次10 min，根据Mark标志，切取目的条带，目的条带分别加入Bcl-2、Bax、cleaved caspae-3、JNK、p-JNK、c-Jun 和p-c-Jun抗体(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜(超过16 h)，PBST洗3次，每次10 min，用相应的辣根过氧化物酶标记的兔Ⅱ抗(1∶5 000稀释)室温孵育2 h，PBST洗3次，每次10 min，最后在膜上滴加ECL发光液，使用凝胶成像仪成像，用Quantity one软件对结果进行分析；β-actin或GAPDH作为内参照。实验重复3次。

4统计学处理

使用 SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准误(mean±SEM) 表示，组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较用 Turkey 法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1RGC-5细胞鉴定

尤其是在新医改环境要求下，医学装备的全生命周期管理，未来还将与医学技术评估相结合。因此，医学装备的先进性、合理性与经济学适用性、效益性原则等，都将密切关联。何斌希望从眼下维保规范化效益的小切口入手，能为将来整个医学技术评估工作的开展奠定良好的数据基础。

采用免疫荧光实验对体外培养的RGC-5细胞株进行鉴定，以观察体外培养的RGC-5细胞表达RGCs特异性蛋白的情况。MAP-2为神经微管结合蛋白，是神经元的特异性标记物；Brn-3为视网膜神经节细胞特异性标记蛋白。实验取贴壁后生长状态良好的RGC-5细胞进行MAP-2和Brn-3染色，用荧光显微镜进行观察，结果显示所有RGC-5细胞均表达MAP-2和Brn-3蛋白，表明此细胞株具有RGCs的部分特性，可用于体外实验，见图1。

Figure 1.Immunolocalization studies for Brn-3 and MAP-2 in RGC-5 cells.

图1免疫荧光检测RGC-5细胞系Brn-3和MAP-2蛋白的表达

2MTT结果

采用MTT实验检测不同浓度的t-BHP和lutein作用于RGC-5细胞24 h细胞活力的变化。结果显示：随着t-BHP浓度的升高，RGC-5细胞的活力逐渐下降，当t-BHP浓度为15 μmol/L时RGC-5活力为对照组的44.4%±1.6%(P<0.01)；在20 μmol/L浓度范围内，随着lutein浓度的升高，RGC-5细胞的活力有所增加，与对照组比差异无统计学意义，且在lutein浓度为20 μmol/L时，细胞活力最高；同时使用光学显微镜观察发现，20 μmol/L的lutein 使t-BHP损伤的RGC-5细胞的形态恢复至接近正常组。根据以上结果，确定15 μmol/L t-BHP为损伤模型的浓度，20 μmol/L的lutein为药物保护浓度，见图2。

Figure 2.The effect of lutein on cell viability and morphology in RGC-5 cells exposed to t-BHP. A: RGC-5 cells were treated with t-BHP at various concentrations for 24 h and cell viability was examined by MTT assay; B: RGC-5 cells were treated with lutein at various concentrations for 24 h and cell viability was also detected by MTT assay; C: RGC-5 cells were treated with t-BHP (15 μmol/L) or/and lutein for 24 h and observed by microscope. Mean±SEM.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L.

图2MTT法和光学显微镜观察lutein对t-BHP诱导的RGC-5细胞损伤的影响

3Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测结果

图3为AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡的结果，其中Q1区为正常细胞，Q2区为早期凋亡的细胞，Q3区为晚期凋亡的细胞，Q4区为坏死细胞。结果显示：模型组RGC-5的凋亡率为(36.3±2.1)%，对照组RGC-5的凋亡率为(10.4±0.3)%，lutein保护组RGC-5的凋亡率为(16.8±0.8)%，单独lutein组RGC-5的凋亡率为(9.9±0.6)%，以上结果表明t-BHP 可诱导RGC-5凋亡与对照组比较其凋亡率增加约26%(P<0.01)，加入lutein后，模型组细胞凋亡率下降约10%(P<0.01)，提示lutein可以抑制t-BHP诱导的RGC-5细胞的凋亡，降低其凋亡率。

4免疫荧光染色结果

模型组RGC-5细胞cleaved caspase-3蛋白表达明显增加，表达cleaved caspase-3蛋白的细胞在所有存活细胞所占比例明显高于正常组和单独的药物组，加入lutein后，模型组RGC-5细胞cleaved caspase-3蛋白表达有所减少，表达cleaved caspase-3蛋白的细胞占存活细胞的比例减少。以上结果提示：lutein可以减少t-BHP诱导的RGC-5细胞caspase-3蛋白的活化，见图4。

Figure 3.The effects of lutein (20 μmol/L) on apoptosis in t-BHP (15 μmol/L)-induced RGC-5 cells detected by flow cytometry. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vst-BHP.

图3流式细胞术检测RGC-5细胞凋亡率

Figure 4.Cleaved caspase-3 expression of RGC-5 cells by immunocytochemistry. Nuclear staining of RGC-5 cells by Hoechst 33342.

图4免疫荧光法检测各组RGC-5细胞caspase-3蛋白的活化情况

模型组凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例较对照组增加(P<0.05)，加入lutein后，Bax/Bcl-2下降与对照组接近；活化的凋亡执行蛋白caspase-3 (cleaved caspase-3)在模型组的表达增加，与对照组比差异有统计学意义(P<0.05)，同样，加入lutein后，其表达降低，与模型组比差异有统计学意义(P<0.05)。同时发现 lutein能够降低模型组JNK和c-Jun的磷酸化水平，模型组JNK和c-Jun的磷酸化增加，与对照组比差异有统计学意义(P<0.05)，加入lutein后，其磷酸化水平下降，与模型组比差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明lutein可以降低t-BHP诱导的RGC-5细胞促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例及凋亡执行蛋白caspase-3的活化，同时能降低与JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平，从而抑制t-BHP诱导的RGC-5细胞的凋亡，见图5。

Figure 5.Effect of lutein on Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3, p-c-Jun and p-JNK protein expression in RGC-5 cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vst-BHP.

图5Western blot实验检测各组凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、p-JNK 和p-c-Jun的变化

讨论

RGCs是视网膜神经元的主要成员之一，也是各种眼科疾病侵袭的主要对象，而且RGCs一旦死亡便不可再生，对视觉的损害是不可逆转的[15]。对RGCs保护的研究也有很多，但由于RGCs损伤的多样性及机制的复杂性，目前为止仍未找到能够有效对抗RGCs损伤的药物和方法[16]。本课题组一直致力于研究中药单体对神经元的保护作用，前期实验已证明一些中药单体如人参皂苷Rg1、原花青素等能够对抗氧化应激损伤导致的RGCs凋亡[17]，在此基础上，我们将视角聚焦在眼内含量高、对多种眼科疾病均有改善作用的一种中药单体叶黄素上，研究发现其对多种眼科疾病均有一定的改善作用，但其对RGCs的保护作用以及作用机制的报道不多见[18-19]。因此我们的研究主要集中于lutein对RGCs的保护方面。视网膜的成分比较复杂，由多种神经元组成，RGCs在视网膜各种神经元中所占比例较少，纯化较困难，而且纯化后存活率也难以保证[20],所以我们选择RGC-5细胞系作为RGCs体外实验部分的研究载体，初步观察lutein对RGCs的保护作用。

氧化应激损伤是RGCs损伤致凋亡的常见因素[21]，与线粒体途径关系密切，其中Bcl家族蛋白是线粒体凋亡途径的主要控制因子。本实验通过体外培养RGC-5细胞系，并用t-BHP诱导RGC-5氧化损伤建立损伤模型[22]，观察lutein对t-BHP诱导RGC-5损伤的影响。

首先进行现象的观察，体外培养RGC-5细胞，观察其形态及生长状况，用免疫细胞化学技术鉴定RGC-5特异性蛋白Brn-3和神经元特异性标记蛋白MAP-2的表达情况，发现培养的RGC-5细胞二者均表达，此细胞株可用于后续实验。用MTT法和光学显微镜观察法确定用于造模的t-BHP的浓度和lutein的保护剂量；然后用Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞技术检测lutein对t-BHP诱导RGC-5凋亡的影响，发现lutein能够使t-BHP诱导的RGC-5细胞系的凋亡率下降10%左右，从而起到保护RGC-5的作用，与lutein在视觉中发挥抗氧化作用和抗凋亡作用一致[23]。

然后探讨lutein对抗t-BHP 诱导RGC-5凋亡作用的机制。长期慢性氧化应激会造成细胞损伤，并激活应激敏感的信号通路，导致细胞凋亡的产生，丝裂原激活的蛋白激酶家族(MAPKs)成员对这一进程的发展起至关重要的作用[24]。MAPKs包括细胞外信号调节激酶(ERKs)、c-Jun 氨基末端激酶(JNKs)/应激活化蛋白激酶、p38以及其它激酶，其中ERKs通路主要调控细胞增殖，JNKs和p38通路与细胞应激和细胞凋亡有关，同时caspase-3依赖的线粒体凋亡途径与JNK的磷酸化密切相关[25]。Caspase-3的活化是凋亡过程的重要阶段,本实验显示lutein能够减少t-BHP诱导的RGC-5细胞表达cleaved caspase-3蛋白；用Western blot技术检测凋亡相关蛋白的表达，发现lutein能够降低t-BHP 诱导的RGC-5细胞Bax/Bcl-2比例和cleaved caspase-3的表达从而抑制t-BHP 诱导的RGC-5细胞的凋亡，其机制可能是通过调控JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平实现，即lutein能够降低t-BHP 诱导的RGC-5细胞JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平，从而抑制t-BHP诱导的RGC-5细胞凋亡。

本部分实验结果表明RGC-5细胞系表达Brn-3蛋白和MAP-2蛋白，t-BHP诱导体外培养的RGC-5细胞发生氧化应激损伤，可能通过激活JNK信号通路，使其发生磷酸化，磷酸化的JNK通过影响Bcl-2家族成员到线粒体的转位，造成线粒体功能障碍和caspase-3的活化从而引起凋亡，而lutein能够通过逆转上述过程发挥其对RGC-5的保护作用，在防治以氧化应激损伤为靶点的视网膜疾病方面具有潜在的应用价值。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Lutein suppresses t-BHP-induced apoptosis in retinal ganglion cells

ZHANG Chan-juan1,2, ZHAO Jia-yi1, HUANG Cui-qin1, LI Qin1, WANG Zhen1, GAN Dan-hui1, ZHU Li-hong1, LU Da-xiang1

(1DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofNursing,AnhuiVocationalInstituteofPopulation,Chizhou247099,China.E-mail:ldx@jnu.edu.cn)

[KEY WORDS]Tert-butyl hydroperoxide; Lutein; RGC-5 cell line; Apoptosis

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effects of lutein on retinal ganglion cellsinvitro. METHODS: The effect of lutein on tert-butyl hydroperoxide (t-BHP)-treated retinal ganglion cells (RGC-5 cell line) was determined. The protein expression of Brn-3 and MAP-2 was examined by the method of immunocytochemistry to identify the RGC-5 cells. The RGC-5 cells were induced by a 24 h exposure of t-BHP, and the cell viability was examined by MTT assay. The apoptotic ratio of the RGC-5 cells after exposed to t-BHP or/ and lutein treatment was analyzed by flow cytometry assay with Annexin V-FITC /PI staining. The activation of caspase-3 was detected by immunocytochemistry and the protein levels of Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3, JNK and c-Jun were determined by Western blot. RESULTS: The RGC-5 cells expressed Brn-3 and MAP-2 proteins. Lutein treatment prevented t-BHP-induced RGC-5 cell apoptosis and increased the cell activity. Compared with control group, exposure of the RGC-5 cells to t-BHP decreased the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2, increased the Bax/Bcl-2 ratio, up-regulated the level of cleaved caspase-3, also promoted the phosphorylation of JNK and c-Jun. Lutein partly reversed the effects of t-BHP on the RGC-5 cells mentioned above. CONCLUSION: Lutein protects RGC-5 cells against t-BHP-induced apoptosis by up-regulating Bcl-2 expression and inhibiting caspase-3 activation through modulating the JNK signaling pathway.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1043- 08

[收稿日期]2016- 01- 15[修回日期] 2016- 03- 11

*[基金项目]国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2011CB707501)；国家自然科学基金资助项目(No.81371442)；广州市科技计划项目重大专项(No.11BppZXaa2070006)

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[中图分类号]R329.21

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.014