白花丹醌对人肝星状细胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影响*

杨成芳，　李　丽，　李勇文，　钟毓娟，　熊美丽，　方舒萍

(桂林医学院，广西 桂林 541004)



白花丹醌对人肝星状细胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影响*

杨成芳，李丽△，李勇文，钟毓娟，熊美丽，方舒萍

(桂林医学院，广西 桂林 541004)

[摘要]目的： 研究白花丹醌(plumbagin)对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的体外培养人肝星状细胞(HSC-LX2)NADPH氧化酶4(Nox4 )的mRNA和蛋白表达、活性氧簇(ROS)水平及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响。方法: 体外培养HSC-LX2，随机设立空白组、TGF-β1刺激的模型组、TGF-β1+ plumbagin (2 μmol/L、1.5 μmol/L及1 μmol/L)组；细胞与各药物共同孵育72 h后，采用RT-PCR检测细胞Nox4 mRNA的表达；原位装载探针法测定细胞内ROS的水平；Western blot检测细胞内Nox4和α-SMA的蛋白含量。结果: 与模型组比较，白花丹醌作用72 h后，2 μmol/L和1.5 μmol/L plumbagin能明显降低HSC-LX2细胞Nox4 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)，下调ROS水平，降低α-SMA的蛋白表达(P<0.01)。结论: Plumbagin可能是通过下调Nox4的表达进而降低ROS生成从而发挥其抑制HSC-LX2细胞活化的作用。

[关键词]白花丹醌； 转化生长因子β1； HSC-LX2细胞； NADPH氧化酶4； 活性氧簇； α-平滑肌肌动蛋白

研究显示氧化应激可以诱导人肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化，其中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)与HSCs的活化密切相关，其活化后高表达的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)具有调节、分泌细胞因子和基质金属蛋白酶并产生大量的细胞外基质，这些是肝纤维化的细胞学基础[1-2]。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)、一氧化氮合酶、环氧合酶、细胞色素P450氧化酶和黄嘌呤氧化酶等所催化的反应过程中均伴有ROS的产生[3]。 Nox至少有7种亚型，在肝脏中Nox4是介导ROS产生的最主要的Nox亚型，在肝细胞、肝星状细胞和肌纤维母细胞内Nox4的表达远远高于其它亚型[4-5]。由Nox4产生的ROS可介导丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路激活，促进HSCs的激活并抑制其凋亡，最终导致肝纤维化的形成[4,6-7]。本课题组前期研究发现白花丹醌能抑制HSC的增殖与活化，国内也有相关的研究，但其通过抗氧化应激作用抑制HSC-LX2细胞株的增殖与活化尚未有文献报道。转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是作用最强的促肝纤维化因子[8-9]。本研究拟用TGF-β1刺激HSC-LX2细胞建立活化的HSC-LX2细胞模型，旨在探讨白花丹醌抑制HSC-LX2细胞活化的分子机制。

材料和方法

1实验材料

1.1细胞来源人肝星状细胞株HSC-LX2(博慧斯生物医药科技有限公司)。

1.2药物与试剂白花丹醌、维生素E(vitamin E，Vit E)和LY364947(TGF-β1受体抑制剂)均购自Sigma；高糖DMEM培养基和胎牛血清(HyClone)；TGF-β1、novoprotein、RNApure高纯总RNA快速提取试剂盒和2×Taq PCR Master Mix(北京艾德莱生物)；TIANScript cDNA 第1链合成试剂盒(TIANGEN)；兔抗人Nox4单克隆抗体(上海生工)；鼠抗人GAPDH/α-SMA单克隆抗体(Aidlab Biotechnologies)； HRP 标记山羊抗兔/兔抗鼠 II 抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)； ROS探针(Cayman)。

1.3主要仪器CO2培养箱(Thermo)；高速冷冻离心机(Eppendorf)；PTC-220多通道PCR仪(MJ)；核酸蛋白测定仪(Shimadzu)；倒置相差显微镜(Zeiss)；DYY-6D凝胶电泳仪/电泳槽(北京赛因坦科技有限公司)；JS-780全自动凝胶成像分析系统(上海培清科技)；蛋白电泳仪/电转膜仪(JY600C,上海生工)。

2实验方法

2.1细胞培养将人肝星状细胞系HSC-LX2置于10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的高糖DMEM培养液，37 ℃、5% CO2条件下培养，隔天换液，待细胞长至70%～80%密度时用0.25%的EDTA胰蛋白酶消化，每2～3 d传代1次，每次实验均取呈指数生长的细胞进行。

2.2MTT法检测白花丹醌对TGF-β1+LY364947作用后HSC-LX2细胞活力的影响MTT操作步骤参照文献[10]进行。对照组加入含终浓度为5 μg/L 的TGF-β1+终浓度为1 μmol/L的LY364947，各给药组在对照组的基础上加入含各浓度的药物作用72 h，各组白花丹醌终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、8、16和32 μmol/L，每组设6个复孔。计算细胞活力抑制率。细胞活力抑制率=(A对照组-A给药组)/A对照组×100%。

2.3RT-PCR和Western blot实验的细胞分组及处理空白对照组：加入胎牛血清的DMEM高糖培养液；模型组：加入含TGF-β1终浓度为5 μg/L胎牛血清DMEM高糖培养液；白花丹醌高、中、低浓度组：在加入终浓度为5 μg/L TGF-β1刺激24 h基础上加入白花丹醌作用72 h，终浓度分别为2 μmol/L、1.5 μmol/L和1 μmol/L[11]。

2.4RT-PCR检测HSC-LX2细胞 Nox4的mRNA表达采用TRIzol法抽提细胞中总RNA。用核酸蛋白测定仪测定RNA含量和纯度，A260/A280均在1.8～2.0之间；取总RNA 5 μg，采用M-MuLV 逆转录酶将其逆转录成cDNA；用Primer Premier 5.0自行设计引物，Nox4的上游引物序列为5’-CCGAACACTCTTGGCTTACC-3’，下游引物序列为5’-CACTGAGAAGTTGAGGGCATT-3’；β-actin的上游引物序列为5’-CACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’，下游引物序列为5’-CGTACAGGTCTTTGCGGATGTC-3’。所得cDNA按2×Taq PCR Master Mix试剂盒说明，加2 μL cDNA模板扩增基因片段，PCR反应参数为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 5 min。反应结束后取10 μL RT-PCR产物及8 μL DNA marker进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果经培清JS-780全自动凝胶成像分析系统进行分析，样本Nox4的mRNA PCR产物条带的光密度与内参照β-actin的mRNA PCR产物条带的光密度(A)比值作半定量分析。实验重复3次。

2.5原位装载探针法检测HSC-LX2细胞内ROS的生成将呈指数生长的HSC-LX2细胞以每孔5×103的密度接种于6孔板，分为空白对照组、TGF-β1模型组、Vit E(200 mg/L)组[12]以及白花丹醌2 μmol/L、1.5 μmol/L和1 μmol/L组。药物与细胞共孵育72 h后，弃培养基，除正常组外，各组加含TGF-β1终浓度为5 μg/L的培养基，置37 ℃孵育30 min，弃培养基，加入含ROS探针终浓度为10 μmol/L的培养基，37 ℃避光孵育25 min，PBS洗3次，荧光显微镜下观察、拍照。实验重复3次。

2.6Western blot检测细胞内Nox4和α-SMA的蛋白含量低温提取细胞总蛋白，改良BCA法测定蛋白浓度，每孔上样50 μg蛋白，12% SDS-PAGE分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别滴加GAPDH、Nox4和α-SMA(1∶500) I 抗，4 ℃摇床过夜，洗膜，加 II 抗(1∶5 000)室温孵育1 h，洗膜后将超敏ECL发光液滴加到膜上，当条带充分显色后，压X光片，暗室曝光5～10 s，将X胶片进行显影、定影后可见到清晰条带。所得胶片经JS-780全自动凝胶成像分析系统进行灰度值分析。实验重复3次。

3统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件分析数据，计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，各组均数间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1白花丹醌对TGF-β1+LY364947作用后HSC-LX2细胞活力的影响

如图1所示，HSC-LX2细胞经过TGF-β1+LY364947处理后，白花丹醌在0.25～ 2 μmol/L之间对细胞活力的抑制率小于10%，说明白花丹醌在这个范围内对正常的HSC-LX2细胞的毒性较小。

Figure 1.The effect of plumbagin on the HSC-LX2 cells after treated with TGF-β1 and LY364947. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs0 μmol/L.

图1白花丹醌对经TGF-β1及LY364947作用后HSC-LX2细胞活力的影响

2白花丹醌对HSC-LX2细胞Nox4 mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示，与空白对照组比较，模型组HSC-LX2细胞中Nox4 mRNA的表达明显增强(P<0.01)；与模型组相比，2 μmol/L组和1.5 μmol/L白花丹醌作用72 h后，HSC-LX2细胞Nox4 mRNA的表达明显下降(P<0.01),见图2。

3白花丹醌对HSC-LX2细胞内ROS水平的影响

原位装载探针法检测结果显示，与空白对照组相比，模型组HSC-LX2细胞内绿色荧光明显增强，表明ROS水平明显升高。与模型组相比，Vit E组细胞内绿色荧光信号明显减弱；白花丹醌各浓度组可不同程度下调ROS的表达，随着白花丹醌浓度的增加，HSC-LX2细胞内荧光强度明显减弱且发绿色荧光的细胞数明显减少，白花丹醌2 μmol/L组与Vit E组细胞内的荧光信号强度相当，见图3。

Figure 2.The effect of plumbagin on the mRNA expression of Nox4 in the HSC-LX2 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control;△△P<0.01vsTGF-β1.

图2白花丹醌对HSC-LX2细胞Nox4 mRNA表达的影响

4白花丹醌对HSC-LX2细胞Nox4和α-SMA蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，与空白对照组相比，TGF-β1刺激后,HSC-LX2细胞内Nox4和α-SMA的蛋白表达显著增加(P<0.01)。与模型组相比，2 μmol/L和1.5 μmol/L浓度白花丹醌作用72 h后，Nox4和α-SMA的蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

讨论

肝星状细胞是肝纤维化时产生过量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的主要来源细胞，其活化增殖是肝纤维化形成的关键。逆转肝纤维化关键在于减少活化的HSCs数量[13-14]。HSCs活化时具有高度增殖活性并能转化为高表达α-SMA的肌成纤维细胞，合成大量ECM，故α-SMA的表达被认为是HSCs活化的显著特征之一[15]

研究显示，在各种炎症刺激因子、生长因子和促纤维化因子中，TGF-β1是作用最强的促肝纤维化因子[8-9]，它除了能促进HSCs的增殖与活化，还能通过自分泌机制产生扩增效应。据报道[4，16]，Nox在肝纤维化进程中发挥着重要作用，在肝纤维化动物模型及肝纤维化病人病程中均伴随Nox4的增加，其通过调节肝细胞的凋亡和肝星状细胞的活化促进肝纤维化的发展。现已证明，由Nox4产生的ROS是细胞内信号转导的第二信使[17]，介导了各种促肝纤维化因子在细胞内信号转导。研究表明，ROS可直接刺激HSCs的增殖与活化，促进肝纤维化的发生[1,18-19]。本研究结果显示，TGF-β1刺激后模型组HSC-LX2中Nox4 mRNA及蛋白表达明显增强、ROS水平明显升高、α-SMA蛋白呈现强表达，表明活化的HSC-LX2细胞模型建立成功。

Figure 3.The effect of plumbagin on ROS production in the HSC-LX2 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control;△△P<0.01vsTGF-β1.

图3白花丹醌对HSC-LX2细胞ROS生成的影响

本课题组前期研究显示白花丹醌能明显抑制TGF-β1刺激的HSC-LX2细胞的增殖和活化，IC50为1.72 μmol/L，呈剂量依赖性[11]。本研究结果显示HSC-LX2细胞经过TGF-β1+LY364947处理后，白花丹醌在0.25～2 μmol/L之间对细胞活力的抑制率小于10%，说明白花丹醌在0.25～2 μmol/L范围内对正常HSC-LX2细胞的毒性较小，而对TGF-β1刺激的活化型HSC-LX2的生长具有明显的抑制作用。TGF-β1刺激后模型复制成功后，给予白花丹醌作用72 h，HSCs中Nox4 mRNA及蛋白表达、ROS水平及α-SMA蛋白明显减少，提示白花丹醌抑制HSCs增殖和活化功能的机制之一可能与抑制Nox4及ROS的表达等抗氧化功能有关，关于其抑制Nox4后ROS生成减少介导的细胞内信号通路的改变有待进一步研究。

Figure 4.The effect of plumbagin on the protein expression of Nox4 and α-SMA in the HSC-LX2 cells detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control;△△P<0.01vsTGF-β1.

图4白花丹醌对HSC-LX2细胞中Nox4和α-SMA蛋白表达的影响

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*[基金项目]哈医大一院科研基金(No. 2013Y01)

Effect of plumbagin on levels of Nox4/ROS and α-SMA in human hepatic stellate cellsYANG Cheng-fang, LI Li, LI Yong-wen, ZHONG Yu-juan, XIONG Mei-li, FANG Shu-ping

(GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China.E-mail: 31910753@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of plumbagin on the mRNA and protein expression of nicotinamide adenine dinucleotidephosphate oxidase 4 (Nox4)， reactive oxygen species (ROS) level and protein expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) in the HSC-LX2 cells stimulated with transforming growth factor β1 (TGF-β1) in vitro. METHODS: HSC-LX2 cells were cultured in vitro and divided into blank group, model group, high-, medium- and low-dose (2, 1.5 and 1 μmol/L) plumbagin groups. After incubated with each drug for 72 h, the mRNA expression of Nox4 was detected by RT-PCR. ROS levels were tested by in situ loading probe method. The protein contents of Nox4 and α-SMA were measured by Western blot. RESULTS: Compared with model group, after treated with plumbagin for 72 h, the mRNA expression of Nox4, ROS level and α-SMA protein were significantly decreased in high-and medium-dose plumbagin groups (P<0.01). CONCLUSION: Plumbagin inhibits the activation of HSC-LX2 cells via decreasing the expression of Nox4, thus decreasing ROS levels.

[KEY WORDS]Plumbagin; Transforming growth factor-β1; HSC-LX2 cells; Nicotinamide adenine dinucleotidephosphate oxidase 4; Reactive oxygen species; α-Smooth muscle actin

通讯作者△Tel: 0451-85555208； E-mail： cangsang01@tom.com

[收稿日期]2015- 05- 11[修回日期] 2015- 10- 09

[文章编号](责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)1000- 4718(2015)12- 2254- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.023

[中图分类号]R363.1

[文献标志码]A