1-磷酸鞘氨醇受体2抑制脂多糖诱导的急性肺损伤*

李秀国，　延光海，　张永吉，　多久和阳，　崔　弘△

(1延边大学医学院，吉林 延吉 133002； 2金泽大学大学院医学部循环医科学血管分子生理学，日本 金泽 920-8640)



1-磷酸鞘氨醇受体2抑制脂多糖诱导的急性肺损伤*

李秀国1，延光海1，张永吉1，多久和阳2，崔弘1△

(1延边大学医学院，吉林 延吉 133002；2金泽大学大学院医学部循环医科学血管分子生理学，日本 金泽 920-8640)

[摘要]目的： 探讨1-磷酸鞘氨醇受体2(S1P2R)对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)中的作用及机制。方法: 野生小鼠和S1pr2-/-小鼠经气管滴注LPS，建立急性肺损伤动物模型。LPS注射24 h时观察肺组织的病理改变，测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白浓度、总细胞数、中性粒细胞的比值及TNF-α、IL-6细胞因子的表达。为了观察S1P2R在肺损伤中的作用机制，LPS注射10 min前野生小鼠和S1pr2-/-小鼠经尾静脉注射一氧化氮合酶抑制剂L-NAME，LPS注射12 h时，再观察肺的病理组织学变化以及BALF中的蛋白浓度，总细胞数及TNF-α、IL-6细胞因子表达的变化。结果: 与野生小鼠比较，S1pr2-/-小鼠恶化LPS诱导的急性肺损伤，BALF中的蛋白浓度、总细胞数，中性粒细胞比值及炎症细胞因子表达显著增加。而L-NAME的预处理显著抑制在S1pr2-/-小鼠LPS诱导加重的急性肺损伤。结论: S1P2R通过抑制NO合成，维持血管屏障，从而抑制急性肺损伤。

[关键词]1-磷酸鞘氨醇受体2; 急性肺损伤; 一氧化氮

1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是鞘磷脂的代谢产物之一，是目前备受关注的脂质信号分子，是一种具有多种生物学功能的溶血磷脂，广泛存在于血液、淋巴液、红细胞、中性粒细胞、血小板等体液和细胞中[1]，通过细胞表面特定的受体而调控细胞的增殖、运动、存活、细胞间黏附、细胞分化等多种重要的生物学作用[2-3]。S1P通过细胞膜表面特异的受体G蛋白偶联受体与1-磷酸鞘氨醇受体1(sphingosine-1-phosphate receptor-1， S1P1R)、S1P2R、S1P3R、S1P4R、S1P5R 结合发挥其生物学作用[4]。近年来研究发现，S1P/鞘氨醇激酶 (sphingosine kinase,SPHK)信号通路通过参与多种细胞的炎症机制以及内皮细胞屏障保护功能对肺部疾病的病理生理改变发挥其重要作用[5-6]，但是确切机制尚不完全明了。本实验主要研究，在血管内皮细胞中高表达的S1P2R对LPS诱导的急性肺损伤(acute lung injury，ALI)小鼠的作用及其机制。

材料和方法

1材料

实验动物选用8～10周龄S1pr2-/-小鼠及同窝出生的野生小鼠(C57BL/6J)，雌雄各半，体质量为22～25 g，由金泽大学医学部实验动物中心提供。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)购自Sigma；ELISA试剂盒购自RB。

2方法

2.1急性肺损伤模型的建立小鼠乙醚麻醉，进行颈部切开，暴露气管，用27G注射针经气管滴注100 μL LPS溶液(溶于生理盐水，给药剂量4 mg/kg)，而后将小鼠直立，垂直旋转小鼠，使药物在肺内均匀分布，然后颈部皮肤缝合。阴性对照组为气管内滴注100 μL生理盐水。L-NAME(25 g/L生理盐水)预处理组在LPS注射10 min前经尾静脉注射L-NAME。

2.2肺组织病理检查经气管滴注LPS 12 h或24 h时将小鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg，进行麻醉，打开腹腔，腹主动脉切断，放血。暴露气管和肺，用1根导管插入气管，结扎固定后，以距水平20 cm高度注入4%多聚甲醛进行内固定。内固定后拔出导管，结扎气管，将全肺置于4%多聚甲醛中固定24 h，然后将肺组织常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察肺组织炎性细胞浸润、水肿以及损伤情况。

2.3支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的收集经气管滴注LPS 12 h或24 h时将小鼠腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg，进行安乐死后，暴露气管，用一次性静脉留置针进行气管插管，丝线结扎固定，然后取生理盐水用1 mL注射器进行支气管肺泡灌洗。每次取1 mL生理盐水，经气管套管冲洗双侧支气管肺泡，反复注入、回收3次后收灌洗液，重复3次，回收率超过80%。将BALF以4 ℃、150×g离心10 min，取上清，保存于-80 ℃冻存，备测生化指标，细胞进行分类计数。

2.4BALF的蛋白浓度测定取-80 ℃冻存BALF上清液，室温水浴快速化冻，Lowry法进行蛋白含量测定。

2.5BALF的细胞分类计数将BALF细胞沉淀以100 μL生理盐水重悬，取10 μL悬液与台盼蓝混匀，于血球计数板上行细胞计数。100 μL PBS重悬后经细胞涂片机涂片，晾干后瑞氏快速染色。光学显微镜下细胞分类计数，取300个细胞，计算中性粒细胞等炎性细胞所占的百分比。

2.6BALF中TNF-α和IL-6测定取-80 ℃冻存BALF上清液，室温水浴快速化冻，按试剂盒操作说明书分别进行TNF-α和IL-6测定。

3统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用GraphPad Prism软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1S1P2R对LPS诱导的肺损伤的作用

1.1肺组织病理变化野生型和S1pr2-/-小鼠经气管注射LPS 24 h时，病理切片检查结果表明，模型组肺组织呈现典型的ALI病理改变，炎症细胞浸润，间质肥厚，肺泡水肿等血管通透性亢进型急性肺损伤的病理现象。与野生小鼠比较S1pr2-/-小鼠更加显著，表明S1P2R基因缺陷恶化LPS诱导的肺损伤,见图1。

1.2BALF中蛋白含量和细胞数测定LPS波及的肺泡腔炎症，通过测定BALF中的蛋白浓度、总细胞数以及中性粒细胞比值进行评价。野生型和S1pr2-/-小鼠经气管内注射LPS 24 h时，发现BALF中的总蛋白浓度、总细胞数以及中性粒细胞比值都显著增加(P<0.01)，见图2。

1.3BALF中TNF-α和IL-6的测定LPS使肺内大量单核巨噬细胞、淋巴细胞聚集和过度活化，引起严重的肺部炎症。野生型和S1pr2-/-小鼠经气管内注射LPS 24 h时，发现BALF中的TNF-α和IL-6细胞因子表达显著增高，见图3。

Figure 1.The effects ofS1P2Rdeficiency on LPS-induced ALI. The presentative images of HE-stained sections of the lung were showed. The scale bar=50 μm.

图1S1P2R基因缺失对LPS诱导的急性肺损伤的作用

Figure 2.The effects ofS1P2Rdeficiency on LPS-induced increases in total protein concentration, total cell number and neutrophil infiltration in BALF.Mean±SD.n=5.**P< 0.01vssaline；##P<0.01vsWT group.

图2S1P2R基因缺失增加BALF中LPS诱导的总蛋白浓度，总细胞数和中性粒细胞浸润

Figure 3.The effects ofS1P2Rdeficiency on LPS-induced changes of TNF-α and IL-6 in BALF.Mean±SD.n=5.**P<0.01vssaline；##P< 0.01vsWT.

图3S1P2R基因缺失对LPS诱导的BALF中TNF-α和IL-6表达的影响

2L-NAME在S1pr2-/-小鼠LPS诱导的急性肺损伤中的作用

2.1肺组织的病理变化LPS注射10 min前小鼠行尾静脉注射L-NAME，检测一氧化氮合酶抑制剂在S1pr2-/-小鼠LPS诱导的肺损伤中的作用。LPS注射12 h时，在野生小鼠和S1pr2-/-小鼠的肺组织中发现炎症细胞浸润、间质肥厚等肺组织的ALI病理改变，与野生小鼠比较，在S1pr2-/-小鼠中更加严重。而L-NAME预处理显著抑制在S1pr2-/-小鼠中LPS诱导加重的急性肺损伤，见图4。

Figure 4.The effects of L-NAME on LPS-induced acute lung injury in WT andS1pr2-/-mice. The representative images of HE-stained sections of lung were showed. The scale bar=100 μm.

图4L-NAME在野生小鼠和S1pr2-/-小鼠LPS诱导的急性肺损伤中的作用

2.2BALF中蛋白含量、细胞数及TNF-α、IL-6测定LPS注射12 h时，L-NAME预处理显著减少了在S1pr2-/-小鼠BALF中蛋白浓度、总细胞数以及TNF-α、IL-6表达的增加，见图5、6。

Figure 5.The effects of L-NAME on LPS-induced increases in total protein concentration and total cell number in BALF.Mean±SD.n=5.**P<0.01vsLPS；##P<0.01vsWT.

图5L-NAME对LPS诱导增加的BALF中蛋白浓度和总细胞数的影响

Figure 6. Effects of L-NAME on LPS-induced increases in TNF-α and IL-6 level in BALF. Mean±SD.n= 5.**P< 0.01vsLPS；##P<0.01vsWT.

图6L-NAME对LPS诱导增加的BALF中TNF-α和IL-6表达的影响

以上结果表明，S1P2R基因表达的缺失使LPS诱导的急性肺损伤恶化，而这与一氧化氮合酶生成的一氧化氮(nitric oxide，NO)有关。

讨论

S1P通过与G蛋白偶联的S1P受体发挥作用，研究证实S1P通过激活不同受体的信号途径对肺部疾病的发生发展起重要作用[7]。Milara等[8]研究发现S1P通过激活Gi蛋白和细胞内Ca2+-PLD-ERK1/2信号通路，促使肺泡上皮细胞分泌IL-8和ICAM-1表达增加。在脂多糖诱导的巨噬细胞炎症模型中，S1P可使巨噬细胞从促炎作用向抗炎作用转换，且引起TNF-α、IL-12等促炎因子减少[5]。LPS诱导的小鼠肺损伤模型中也可发现S1P和S1PR1选择性激动剂可通过对肺血管通透性的保护作用降低炎症诱导的肺渗漏[9-10]。在急性肺损伤的病理过程中，S1P发挥及其重要作用。但是S1P1R以外的S1P受体在急性肺损伤中的作用尚不清楚。LPS诱导的肺损伤模型广泛应用于急性肺损伤研究。LPS激活肺泡上皮细胞和巨噬细胞等，进而释放出TNF-α、 IL-6等炎症细胞因子及组织损伤性物质，导致血管内皮细胞损伤，同时肺泡上皮细胞损伤，最后引起血管通透性升高，造成水肿及大量单核巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润[11-12]。

本研究主要关注在血管内皮中高表达的S1P2R，利用S1P2R基因敲除小鼠，观察LPS诱导的急性肺损伤中S1P2R的作用及其作用机制，发现与野生小鼠比较，S1pr2-/-小鼠在LPS诱导的急性肺损伤中病情更加恶化。LPS气管内注射24 h时，在野生小鼠和S1pr2-/-小鼠的肺组织中发现了LPS诱导的肺泡水肿，肺泡壁肥厚以及炎症细胞浸润等血管通透性亢进型急性肺损伤的病理现象，与野生小鼠比较，S1pr2-/-小鼠更加严重。LPS诱导BALF中的总蛋白浓度、总细胞数以及中性粒细胞增加，与野生小鼠比较，在S1pr2-/-小鼠中更加显著。同样，LPS注射后与野生小鼠比较，BALF中TNF-α和IL-6炎症因子表达在S1pr2-/-小鼠显著增加。以上结果表明，S1P2R基因缺失小鼠在LPS诱导的急性肺损伤中病情恶化，S1P2R在减轻LPS诱导的急性肺损伤中发挥保护作用。

最近的研究表明，NO在炎症反应和微血管通透性增加过程中起重要的作用[13-14]。本研究探讨一氧化氮合酶抑制剂L-NAME在S1pr2-/-小鼠中LPS诱导的急性肺损伤的作用。发现在S1pr2-/-小鼠经L-NAME预处理后，发生LPS诱导的急性肺损伤时BALF中的总蛋白浓度、细胞总数以及TNF-α和IL-6细胞因子表达显著被抑制。相反，在野生小鼠中L-NAME的效果不显著。可知S1P2R基因缺失导致的血管通透性亢进和炎症细胞浸润，与一氧化氮合酶的生成是不可分的。一氧化氮合酶分为内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神经型一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)[15-16]。主要表达在血管内皮细胞的eNOS和表达在炎症细胞、肺泡巨噬细胞及肺泡上皮细胞的iNOS，可能参与S1P2R基因缺失导致血管通透性亢进的病理过程。本课题组在最近的研究中发现，S1pr2-/-小鼠全身过敏反应动物模型以及体外培养细胞实验中，在血管内皮表达的S1P2R介导抑制Akt/eNOS信号传导途径，抑制血管通透性[17]。S1pr2-/-小鼠恶化LPS诱导的肺损伤可能也与S1P2R基因缺失而激活内皮细胞的Akt/eNOS信号通路有关，而产生过多的NO引起血管通透性亢进，具体的作用信号途径有待进一步研究。

本研究证实了S1P2R在急性肺损伤等病态血管通透性亢进中的重要作用，S1P2R通过抑制一氧化氮合酶，进而抑制LPS诱导的急性肺损伤。S1P2R选择性激动剂可能成为治疗急性肺损伤新的药物。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81303288)；黑龙江省自然科学基金资助项目(No. p015107)；黑龙江省应用技术研究与开发计划项目院所创新专项(No. 2013G1081)

Sphingosine-1-phosphate receptor-2 attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injuryLI Xiu-cuo1, YAN Guang-hai1, ZHANG Yong-ji1, TAKUWA Yoh2, CUI Hong1

(1CollegeofMedicine,YanbianUniversity,Yanji133002,China;2DepartmentofVascularPhysiology,KanazawaUniversityGraduateSchoolofMedicine,Kanazawa920-8640,Japan.E-mail:cuihong@ybu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects and mechanisms of sphingosine-1-phosphate receptor-2 (S1P2R)on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI). METHODS: ALI model was induced by intratracheal administration of LPS in both wild-type mice and S1P2R-deficient mice. The pathological changes in the lung tissues were observed, and the protein concentration， total cell number, neutrophil ratio, TNF-α level and IL-6 level were determined in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) 24 h after LPS injection. In order to investigate the mechanisms of S1P2R in LPS-induced ALI, 10 min before LPS injection, both wild-type mice and S1P2R-deficient mice were injected with nitric oxide synthase inhibitor by tail vein injection, the pathological changes of the lung tissues were observed, and the protein concentration and total cell number in BALF were determined 12 h after LPS injection. RESULTS: Compared with wild-type mice, S1P2R-deficient mice showed more severe LPS-induced ALI, and the protein concentration, neutrophils and inflammatory cytokines in BALF were significantly increased in S1P2R-deficient mice. Administration of nitric oxide synthase inhibitor Nω-L-nitro-arginine methyl ester protected S1P2R-deficient mice from aggravation of ALI. CONCLUSION: S1P2R mediates the protection from LPS-induced ALI possibly through inhibiting nitric oxide synthase.

[KEY WORDS]Sphingosine-1-phosphate receptor-2; Acute lung injury; Nitric oxide

通讯作者△Tel： 0451-55665478; E-mail: wmzyyjy@163.com

[收稿日期]2015- 05- 27[修回日期] 2015- 09- 07

[文章编号]1000- 4718(2015)12- 2244- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.021

[中图分类号]R363.2+1

[文献标志码]A