Rab蛋白调控葡萄糖转运蛋白4转运机制的研究进展

欧丽婷，许迎科，李汉兵

（1.浙江工业大学药学院药理学科，浙江杭州 310014；2.浙江大学生仪学院生物医学工程系，浙江杭州 310027）

Rab蛋白调控葡萄糖转运蛋白4转运机制的研究进展

欧丽婷1，许迎科2，李汉兵1

（1.浙江工业大学药学院药理学科，浙江杭州 310014；2.浙江大学生仪学院生物医学工程系，浙江杭州 310027）

胰岛素通过刺激葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的转运调节脂肪细胞和肌细胞摄取葡萄糖，维持机体内的血糖平衡。Rab蛋白是GTP结合蛋白。近几年研究表明，Rab蛋白是影响GLUT4转运到细胞膜的重要调控因子，参与GLUT4囊泡的形成转运以及融合等过程。本文综述了几种不同的Rab蛋白以及Rab蛋白的GTP酶激活蛋白即分子质量160 ku蛋白激酶B底物蛋白（AS160）对于GLUT4转运的调控机制。对Rab蛋白调控GLUT4转运机制的研究，有助于解释2型糖尿病的胰岛素耐受机制，并可为糖尿病治疗提供新的方向。

葡萄糖转运体4型；胰岛素类；Rab蛋白；胰岛素受体底物蛋白质类

在脂肪细胞和肌细胞中，胰岛素的刺激使葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）在质膜上重新分布，从而将血液中的葡萄糖摄入到细胞中，降低血糖含量［1］。GLUT4主要在胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪细胞中表达。运动或进食后，GLUT4转运葡萄糖的能力比平时高10 ～40倍，以便满足肌肉运动时向骨骼肌细胞快速提供能量以及进食后快速把血液中的葡萄糖转运到细胞内［2］。在基础状态时，90%GLUT4位于细胞储存囊泡内；受胰岛素刺激后，该囊泡向质膜转移，然后与质膜锚定、融合。GLUT4转位到质膜后活性增加，与葡萄糖结合并使其构象发生改变，此时葡萄糖被转运至细胞内。胰岛素抵抗主要表现为GLUT4膜转位能力受损，同时也是2型糖尿病的主要病因［3］。因此，了解GLUT4的转位以及调控其转位的机制极为重要。Rab蛋白是GTP结合蛋白，作为分子开关，是小分子GTP结合蛋白家族中最大的亚家族，参与一系列生物进程，包括信号传导、膜转运及细胞骨架形成等，它们都涉及细胞GLUT4的转位［4］。本文总结了Rab蛋白和Rab蛋白的GTP酶激活蛋白（Rab GTPase activating protein，Rab-GAP）即分子质量为160 ku的蛋白激酶B的底物蛋白（Akt substrate of 160 ku，AS160）在胰岛素刺激情况下GLUT4从胞内转位至胞膜中所起的作用。

1 葡萄糖转运蛋白4的转运步骤

在脂肪细胞和肌细胞中，GLUT4在细胞内和质膜间循环。在基础状态下＞90%GLUT4位于细胞内，约10%存在于细胞表面。基础状态下GLUT4的稳态分布主要由快胞吞和慢胞吐所维持［5］。胰岛素通过大幅加快GLUT4的胞吐速度改变GLUT4的稳态分布，使其在质膜中的比例增加。GLUT4主要存在于细胞内的储器中，包括反式高尔基体网络（trans Golgi network，TGN）和内吞循环体（endo⁃cytic recycling compartment，ERC）。然而，约50%的GLUT4分子位于特殊的囊泡结构中，即GLUT4特异性囊泡，或GLUT4储存囊泡（GLUT4 storage vesicles，GSV），从TGN和ERC中分离出来［6］。对于GSV的生化和结构性质尚未完全了解，但研究人员已普遍认可胰岛素刺激会导致GLUT4储存囊泡的胞外分泌，主要步骤为：①从TGN和ERC中形成GSV；②GSV沿细胞骨架从细胞内运动到质膜附近；③锚定到质膜上；④与质膜发生融合［7］。尽管我们对GLUT4转位的分子机制已有较深了解，但对于胰岛素调控GLUT4胞外分泌的具体步骤尚不明确，存在许多争议。推测Rab蛋白可能是胰岛素信号应答的调节子，从而连接了信号转导和囊泡转运。

2 AS160在葡萄糖转运蛋白4转运中的作用

AS160所含GAP结构域，能维持靶细胞Rab-GDP形成，影响Rab蛋白的活性，进而抑制GLUT4转运［8］。而胰岛素刺激能缓解AS160的这种抑制作用，促进GLUT4转位。使用磷酸化突变体过表达及基因沉默技术，确定了AS160能把胰岛素信号传递到Rab蛋白上，实现脂肪细胞和肌细胞中GLUT4的转运［9］。

2.1脂肪细胞中AS160对葡萄糖转运蛋白4转运的影响

蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）是磷脂酰肌醇3-激酶信号通路下游胰岛素信号通路中非常重要的蛋白［10］。Lienhard等的研究显示，Akt和Rab蛋白对GLUT4转运调控之间的联系主要是通过AS160实现的［8］。他们发现胰岛素调节AS160磷酸化作用对于3T3-L1脂肪细胞中Rab蛋白调控GLUT4的转运极为重要。AS160包含一个Rab-GAP结构域，2个磷酸酪氨酸结合域（phos⁃photyrosine-binding，PTB）以及1个钙调蛋白结合域（calmodulin-binding domain，CBD）和5个典型的Akt磷酸化位点〔分别为精氨酸（A）973，丝氨酸（S）318，丝氨酸（S）588，苏氨酸（T）642，丝氨酸（S）751〕［11］。正常情况下，胰岛素刺激使AS160中的5个Akt磷酸化位点中的4个位点（S318，S588，T642，S751）突变成丙氨酸后（AS160-4P），经3T3-L1脂肪细胞中过表达能抑制GLUT4的转位［12］。Sano等［13］研究并报道，AS160突变体（丝氨酸或苏氨酸突变成丙氨酸）的过表达会抑制胰岛素刺激下GLUT4在3T3-L1脂肪细胞中的转运，因其会阻止S588或T642的磷酸化作用（T642突变体比S588有一个更强的抑制作用），并且S588和T642同时突变的突变体会比单个突变有更强的抑制作用，还指出A（rg）973被赖氨酸取代的AS160突变体〔A（rg）973-AS160〕会失去Rab-GAP结构活性，阻止脂肪细胞中GLUT4转运。这些实验结果都显示含Rab-GAP活性区域的AS160的选择性Akt磷酸化对胰岛素刺激GLUT4的转运是必不可少的。由此总结出胰岛素刺激Akt磷酸化进而导致AS160选择性磷酸化位点磷酸化，同时抑制其GAP结构域，使附着在GSV上的Rab蛋白结合的GTP不能水解成GDP，从而使Rab蛋白处于与GTP结合的高活性状态，有利于Rab-GTP的累积，进而促进GLUT4囊泡的胞吐过程［14］。以后的实验又随之证明了14-3-3蛋白对磷酸化的T642位点吸引力高而14-3-3蛋白对磷酸化的S341吸引力低，说明胰岛素刺激GLUT4的转运过程涉及14-3-3蛋白绑定到AS160上［15-16］。

2.2肌细胞中AS160对葡萄糖转运蛋白4转运的影响

在L6肌细胞中，野生型AS160的过表达不能改变胰岛素刺激GLUT4的转运，但4P-AS160的表达会抑制GLUT4的转运［17］。4P-AS160以及A（rg）973-AS160会阻止AS160磷酸化作用，继而缓解因AS160磷酸化而导致的GAP区域活性受抑制的过程，从而抑制了Rab-GTP的累积，最终抑制GLUT4的转运［18］。这就证明了在肌细胞中，具有活性的GAP区域对于AS160抑制胰岛素刺激下GLUT4的转运是必不可少的。胰岛素刺激的小鼠胫骨前肌过表达4P-AS160，机体内葡萄糖的摄取比对照组约<50%［19］。T649A-AS160突变型小鼠中（阻止AS160的T649位点磷酸化，相当于人类AS160的T642位点）在胫骨前肌和四头肌中摄取葡萄糖能力降低约<20%［20］。此外，T649A-AS160突变型小鼠体内，胰岛素刺激下GLUT4的膜转运也显著低于野生型小鼠［21］。这些实验结果都说明在肌细胞中胰岛素刺激GLUT4的转运也需要AS160在Akt作用下磷酸化，抑制其GAP区域活性，影响Rab蛋白活性［22］。

在人体内，已知的Rab家族蛋白有70多种。在离体状态中，AS160的GAP区域对于Rab2A，Rab8A，Rab10和Rab14都有活性［23］。在3T3-L1脂肪细胞中，Rab10在胰岛素刺激下GLUT4转运中起了至关重要的作用［24］。但在L6肌细胞中，胰岛素刺激GLUT4转运需要Rab8和Rab13作为AS160的调控蛋白。目前，AS160调控GLUT4的移位的具体步骤仍有争议。有一种假设是AS160主要调节GLUT4囊泡的胞内滞留与释放，并不影响囊泡的栓系，锚定以及融合在细胞质膜上［25］。另一种假设是GLUT4囊泡在滞留处释放后，磷酸化的AS160与14-3-3蛋白结合，AS160的N端PTB区域有利于GLUT4囊泡和质膜的锚定与融合［26］。

3 不同Rab蛋白对葡萄糖转运蛋白4转运的调控

Rab蛋白，是小G蛋白家族最大的一个分支，共有60多种亚基，大约由200个氨基酸组成，分子质量为（20 ～30）ku，是胰岛素刺激下GSV转运到细胞膜的一种重要调控因子［27］。Rab蛋白主要存在于细胞内膜组分中，控制2个邻近细胞器之间的膜转运，不同的Rab蛋白具有不同的分子特异性，在不同内膜组分中造成特异的融合［28］。Rab蛋白与其他小G蛋白一样，有未活化的Rab-GDP形式以及活化的Rab-GTP形式［29］。当Rab蛋白被活化处于Rab-GTP形式时，能激活下游效应蛋白，调控膜转运过程的许多步骤：囊泡转运、栓系、锚定以及融合。与质膜融合后，Rab蛋白又回到Rab-GDP的形式，从膜上分离出来，进入下一次循环［30］。已有很多关于特异性Rab蛋白对GLUT4转运影响的研究，在富含GLUT4的脂肪细胞和肌细胞的内膜中已检测到Rab2，Rab4，Rab8，Rab10，Rab11和Rab14［31］。在这些Rab蛋白中，Rab4和Rab11的突变体能抑制GLUT4的转运，Rab5参与GLUT4的内吞转运［4］。

3.1Rab4调控葡萄糖转运蛋白4转运以及融合

Rab4位于早期/再循环内涵体中，有助于物质的分选和循环过程。Rab4也出现在脂肪细胞和骨骼肌的GLUT4储存囊泡中，胰岛素的刺激会引起脂肪细胞和肌细胞囊泡中Rab4蛋白含量降低［32］。有研究显示，脂肪细胞和肌细胞中，GLUT4和Rab4共定位于低密度微粒体组分中［33］。胰岛素激活了Rab4，后者从胞浆移动到这些微粒组分中，同时GLUT4转运到质膜上［34］。并且，向细胞内导入相当于Rab4的C端片段或过表达野生型Rab4和过表达C端缺失的突变体都会抑制胰岛素刺激下GLUT4的转运［35］。而且，胰岛素刺激Rab4和驱动蛋白间的相互作用，激活下游的非典型蛋白激酶C。这个作用是GLUT4囊泡移动到质膜上所必须的［36］。此外，研究表明，Rab4可通过GTP/GDP的形式直接与突触融合蛋白4（syntaxin4，STX4）作用，调节SNARE复合体中蛋白与蛋白的相互作用，促使GLUT4囊泡融合到质膜中［37］。综上所述，Rab4在GLUT4囊泡的运动以及囊泡的融合中发挥重要的作用。

3.2Rab10促进葡萄糖转运蛋白4的转运

在脂肪细胞中，目前认为AS160最主要的底物是Rab10蛋白。在基础状态下，脂肪细胞中过表达持续激活的Rab10突变体，能增加细胞表面GLUT4的水平［38］。与此相反的是，Rab10基因敲除会降低胰岛素刺激下的GLUT4的转运。关键是基础状态下由于敲除AS160导致细胞表面GLUT4的增加会由于Rab10的敲除而局部受阻，也会由于Rab10的过表达而进一步增加［39］。这表明在基础状态下的细胞中，Rab10通过AS160的作用保持在活化的Rab-GTP形式，使GLUT4滞留在细胞内。Rab10可能作用于GSV，因为无论是敲除还是过表达的Rab10都不能对细胞表面的转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）水平起作用［40］。同时研究发现在胰岛素作用下能移动到质膜上的含GLUT4不含TfR的囊泡，即GSV（GSV含GLUT4不含TfR，核内体含GLUT4也含TfR）中富含Rab10［41］。最近，已确定Dennd4C（DENN/MADD区域含4C，是一种蛋白质编码基因）与鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）一样对Rab10蛋白起作用（激活Rab10蛋白形成Rab10-GTP形式）影响GLUT4转运，但胰岛素的刺激并不能激活DenndC基因［42］。这意味着胰岛素调节Rab10蛋白完全是通过AS160磷酸化的作用。基础状态下的细胞表面GLUT4水平由于Rab10的过表达，AS160的敲除而增加，同时Rab10过表达以及AS160敲除两者结合在胰岛素刺激下会进一步增加细胞表面GLUT4的水平［43］，由此推测，Rab10持续激活的突变体可不依赖于胰岛素信号通路导致GSV向细胞膜移动。全内角反射荧光显微镜的研究进一步支持了这个结论［35］。由此推测，Rab10蛋白在GLUT4转运中所起的作用主要是基础状态下提高细胞内GLUT4水平，激活状态下促进GSV移动到细胞外围。

3.3Rab14调控葡萄糖转运蛋白4从早期的核内体到高尔基体转运

尽管Rab10蛋白是迄今唯一被确定的作用于GSV上的蛋白，但其他Rab蛋白也参与GLUT4的转运过程。用4P-AS160持续激活L6肌细胞，GLUT4的转位受到抑制，Reed等［44］发现过表达野生型Rab14可改善此抑制作用。与此相反的是，不管是野生型的还是持续激活的Rab10都不能恢复L6肌细胞中GLUT4的转位。由此猜测，在离体条件下，Rab14可能是AS160的靶点，会引起细胞中GLUT4的转位。研究表明，Rab14蛋白的敲除会通过早期核内体抑制囊泡和细胞核周围区域的微管中的GLUT4的转运［45］。Ishikura等［46］提出Rab14在GLUT4转运过程中起作用就是控制内化的GLUT4从早期的核内体到高尔基体的运输，推测Rab14激活的突变体通过将GLUT4留在对胰岛素不敏感的TGN和ERC中，进而降低基础状态和胰岛素刺激下细胞表面的GLUT4含量。

3.4Rab8A调控葡萄糖转运蛋白4的锚定

Rab8调控囊泡在TGN和质膜间的转运。通过单个基因敲除发现，在肌肉细胞中，只有Rab8A参与胰岛素刺激导致的GLUT4转运过程，其他2个亚型均未涉及［47］。在肌细胞中，过表达Rab8A会部分缓解因AS160-4P引起的GLUT4转运受阻。更进一步的研究显示，Rab8A蛋白的敲除会减少胰岛素依赖的GLUT4出现在肌肉细胞的膜表面［48］。在肌细胞中用相似的方法处理Rab10蛋白，即敲除Rab10蛋白，不会减少肌细胞膜表面GLUT4的含量［49］，尽管在脂肪细胞中Rab10作为AS160的靶点基因敲除会降低脂肪细胞膜表面的GLUT4含量［50］。因此，Rab8A被认为是肌细胞中GLUT4转运的特异性调控者。已有实验证明Rab8A调控囊泡在TGN和质膜之间的转运［51］。Rab8A与Sec4P高度同源，通过与Sec10P和Sec15P相互作用形成胞外复合体锚定囊泡使其从TGN移动到质膜上［52］，由此推测AS160可能通过Rab8A调控胰岛素刺激下GSV转运中锚定的步骤。

3.5Rab13促进葡萄糖转运蛋白4囊泡和质膜融合

Rab13和Rab8A以及Rab10在进化上密切相关，尽管它们有着不同的C端区域，仍表现出高度的同源性。在肌细胞中，Rab13和Rab8A在细胞中过表达都可修复因AS160-4P的持续激活引起的GLUT4转运受阻［53］。由此可见在肌细胞中，Rab13和Rab8A都作用于AS160的下游，是AS160的靶点，参与胰岛素刺激GLUT4转运的过程。但是Sun等［54］研究发现，Rab13和Rab8A两者调控胰岛素的转运过程中有着不同的激活时间（Rab8A约在2 min被胰岛素激活；Rab13约在5 min）。并且它们的亚细胞定位也不同，Rab13蛋白主要出现在细胞外围，而Rab8A主要在细胞核周围［18］。推测Rab8A在胰岛素敏感的GLUT4囊泡上起作用主要在细胞核周围，而Rab13在GLUT4转运中更多在细胞外围起作用。也有研究证实，Rab13可通过与t-SNARE STX4作用促进细胞外围形态发生变化［55］。在脂肪细胞和肌细胞中，STX4可调节GLUT4囊泡融合到质膜上［56］。由此推测，Rab13主要在GLUT4囊泡融合到质膜过程中起作用。

4 展望

Rab蛋白和AS160与胰岛素的信号传导及GLUT4的转运密切相关，包括连接胰岛素信号与GLUT4转运、GLUT4移位、锚定及与质膜融合等。新型的显微成像技术对细胞内的转运过程有了更深的了解，通过TIRFM显微镜观察到GLUT4转运到质膜附近，但仍不明确GLUT4是如何穿过内膜系统到达质膜附近的。新的显微成像技术对了解GSV的形成以及如何停留在细胞内提供了一个可能的途径。同样，同一个Rab蛋白在肌肉细胞和脂肪细胞中有着不同的表现也有待进一步的研究。

综上所述，Rab蛋白和AS160可能是阻止糖尿病进程的强有力的靶点，发现抑制AS160的药物并阐明其分子机制可能是糖尿病及其并发症治疗的重要突破。

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Role of Rab proteins in glucose transporter 4 translocation：research advances

OU Li-ting1，XU Ying-ke2，LI Han-bing1
（1.Department of Pharmacology，College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.Department of Biomedical Engineering，College of Biomedical Engineering&Instrument Science，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China）

Insulins maintain blood glucose homeostasis in the body by stimulating glucose uptake into muscle and adipose tissues through glucose transporter type 4（GLUT4）translocation.Recent studies have showed that Rab proteins，as a key regulatory factor for the translocation of GLUT4 to the cell membrane，participate in the formation，translocation and fusion of GLUT4 vesicles.This paper describes several types Rab proteins and the Rab GTPase activating protein，protein kinase B substrate of 160 kU（AS160）in terms of regulatory mechanisms for GLUT4 translocation.Studies on the translocation mechanism by which GLUT4 is regulated by Rabs aim to explain the mechanism of insulin resistance in type 2 diabetes，and provide a new approach to diabetes.

glucose transporter type 4；insulins；Rab proteins；insulin receptor substrate proteins

LI Han-bing，E-mail：hanbing.li@163.com，Tel：（0571）88320535

R963

A

1000-3002-（2016）07-0770-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.010

Foundation item：The project supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province（LY14H310003）；Natural Science Foundation of Zhejinag Province（LY13C050001）；and Doctoral Fund of Ministry of Education of China（20130101120172）.

2016-01-04 接受日期：2016-04-07）

（本文编辑：贺云霞）

浙江省自然科学基金（LY14H310003），浙江省自然科学基金（LY13C050001）；教育部博士点基金（20130101120172）

欧丽婷，女，硕士研究生，主要从事糖尿病及并发症病理机制研究。

李汉兵，E-mail：hanbing.li@163.com