三氧化二砷诱导人脑SHG-44胶质瘤细胞凋亡

张旭东　崔大勇　王　新　郭云宝　鲁质成　张　博

(长春中医药大学附属医院神经外科，吉林　长春　130021)



三氧化二砷诱导人脑SHG-44胶质瘤细胞凋亡

张旭东崔大勇王新1郭云宝1鲁质成1张博1

(长春中医药大学附属医院神经外科，吉林长春130021)

〔摘要〕目的观察三氧化二砷(As2O3)对SHG-44胶质瘤细胞增殖抑制的分子机制。方法在加入SHG-44胶质瘤细胞As2O348 h后，采用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)方法检测细胞增殖抑制率；RT-PCR及蛋白免疫印迹(WB)方法，检测BAX及Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平。结果As2O3对SHG-44胶质瘤细胞的抑制作用随着药物浓度的升高而增强；BAX mRNA及蛋白表达水平与对照组比无明显变化(P<0.05)，BAX mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论As2O3通过促进细胞凋亡而抑制SHG-44胶质瘤细胞的增殖。

〔关键词〕三氧化二砷;胶质瘤；细胞凋亡

1吉林大学第一医院神经血管病外科

第一作者：张旭东(1978-)，男，主治医师，主要从事神经血管病的研究。

神经胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤，其发病率高，生长速度快〔1〕。目前，临床上在进行胶质瘤治疗时常采用手术切除为主，放、化疗为辅的治疗方法。但是，患者在治疗后，1年的生存率低于50%，而两年的生存率更是不及10%。目前研究发现三氧化二砷(As2O3)不仅可以治疗血液肿瘤，还可以对其他实体肿瘤有作用，而且关于As2O3对人脑SHG-44胶质瘤细胞的作用也知之甚少。本研究围绕As2O3诱导胶质瘤(SHG-44)细胞凋亡的机制展开，为As2O3将来用于脑内胶质瘤的临床应用提供可靠的实验依据。

1材料与方法

1.1细胞培养及分组实验中使用的人脑SHG-44细胞由中科院上海细胞研究所提供。实验分为对照组、加As2O31 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L。

1.2仪器与试剂Trizol、四甲基偶氮唑盐(MTT)、Taq酶及M-MuLV等购自宝泰克生物试剂公司。二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中山生物技术公司，BAX及Bcl-2单克隆抗体及辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG(H+L)购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.3MTT比色法测定细胞增殖抑制率将SHG-44细胞制成1×105/ml的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μl。孵育24 h后加入10 μl不同浓度的As2O3，对照组加生理盐水。孵育48 h后，各孔加入20 μl 浓度为5 g/L的MTT，继续培养4 h后使用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm波长处吸光度值，计算细胞增殖抑制率。

1.4RT-PCR将加入As2O348 h后的SHG-44细胞按说明书提取总RNA，并进行逆转录及基因片段扩增。引物序列：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'，5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'(452 bp)；Bcl-2：5'-AAC ACC AGA ATC AAG TGT TCG-3'，5'-TCA GGT GGA CCA CAG GTG GC-3'(446 bp)；Bax：5'-AGG GTT TCA TCC AGG ATC GAG C-3'，5'-AGG CGG TGA GGA CTC CAG CC-3'(468 bp)。PCR总反应体积为25 μl ,共30个循环(94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s)，取PCR产物进行电泳，拍照、存盘。

1.5蛋白免疫印迹法(WB)提取各组细胞的总蛋白，Bio-Rad法测定各样本中总蛋白含量。然后40 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、转膜、封闭、加一抗4℃过夜、洗涤、加入二抗、再洗涤，最后显色。SHG-44细胞的生长抑制率(IR)=(1-药物作用组OD值/对照组OD值)×100%。

1.6统计学分析采用SPSS11.0软件，组间比较行t检验。

2结果

2.1不同浓度的As2O3对 SHG-44细胞增殖活性的影响不同浓度的As2O3作用于SHG-44细胞48 h后，根据测得OD值计算抑瘤率，结果显示，As2O3对SHG-44胶质瘤细胞的抑制作用随着药物浓度的升高而增强：1 μmol/L As2O3的IR为(17.63±1.43)%，2 μmol/L时IR为(30.91±2.93)%，4 μmol/L时为(36.77±5.35)%，8 μmol/L时为(50.77±2.81)%。

2.2As2O3对 SHG-44 胶质瘤细胞凋亡基因Bax及核蛋白因子Bcl-2 mRNA的影响RT-PCR的电泳结果显示，分使用1、2、4、8 μmol/L 的As2O3作用于SHG-44细胞48 h后，Bax mRNA的表达含量与未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44细胞相比没有明显的变化(P>0.05)；而Bcl-2 mRNA的表达含量与未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44细胞相比，随着As2O3浓度的增加而减少(P<0.05)。见图1，图2。

图1　凝胶电泳检测SHG-44神经胶质瘤细胞Bax、Bcl-2 mRNA表达

图2　SHG-44神经胶质瘤细胞Bax、Bcl-2 mRNA相对表达量

2.3As2O3对SHG-44细胞凋亡基因Bax及核蛋白因子Bcl-2蛋白的影响分别使用1、2、4、8 μmol/L 的As2O3作用于SHG-44胶质瘤细胞48 h后，Bax蛋白的表达含量与未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44胶质瘤细胞相比没有明显的变化(P>0.05)；而Bcl-2蛋白的表达含量与未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44胶质瘤细胞相比，随着As2O3浓度的增加而减少(P<0.05)。见图3，图4。

图3　SHG-44神经胶质瘤细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达

图4　SHG-44神经胶质瘤细胞Bax、Bcl-2蛋白表达OD值

3讨论

As2O3作为砒霜的主要组成成分，白色粉末，易升华，无特殊气味，微溶于水，易溶于碱和酸。《本草纲目》就曾记载使用砒霜等含有砷成分的药物治疗哮喘、梅毒等。1999年通过了国家药品监督管理局的审批，临床上在2000年开始作为治疗APL而广泛应用〔2〕。本研究结果表明As2O3对SHG-44胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用，并呈剂量依赖性。

细胞凋亡指的是由多个有功能联系的基因激活后引起的蛋白表达以及调控等的作用引起细胞程序性的死亡，是所有生命体都具有的一种基本特征。目前研究表明抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax在细胞凋亡的过程中发挥重要的作用〔3〕，其机制与影响线粒体的功能结构与稳定性〔4～6〕有关。有报道指出〔7〕，细胞凋亡的发生在一定程度上取决于抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白之间的比例，如Bax/Bcl-2比值高的细胞，比Bax/Bcl-2比值低的细胞更易发生凋亡，相反不易发生凋亡。本实验说明As2O3诱导了细胞凋亡的发生。

综上所述，As2O3在体外可以通过促进细胞凋亡而抑制SHG-44胶质瘤细胞的增殖。

4参考文献

1王忠诚.神经外科学〔M〕.武汉:湖北科学技术出版社,1998:424-32.

2Kunrath J,Gurzau E,Gurzau A,etal.Blood pressure hyperreactivity:an early cardiovascular risk in normotensive men exposed to low-to-moderate inorganic arsenic in drinking water〔J〕.J Hypertens,2013;31(2):361-9.

3Hu RG,Lim J,Donaldson PJ,etal.Characterization of the cystine/glutamate transporter in the outer plexiform layer of the vertebrate retina〔J〕.Eur J Neurosci,2008;28(8):1491-502.

4Pacitti D,Wang T,Page MM,etal.Characterization of cytosolic glutathione peroxidase and phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and their modulation by in vitro selenium exposure〔J〕.Aquat Toxicol,2013;130-1:97-111.

5Yildiz D,Cakir Y.Efflux of glutathione and glutathione complexes from human erythrocytes in response to inorganic arsenic exposure〔J〕.Biol Trace Elem Res,2012;150(1-3):451-9.

6Dang TN,Arseneault M,Ramassamy C.Regulation of redox-sensitive signaling pathways in rat primary astrocytes following acrolein exposure〔J〕.J Alzheimers Dis,2011;25(2):263-77.

7Maubach G,Sokolova O,Wolfien M,etal.Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱ contributes to inhibitor of nuclear factor-kappa B kinase complex activation in Helicobacter pylori infection〔J〕.Int J Cancer,2013;133(6):1507-12.

〔2015-03-21修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：张博 (1981-),男，主治医师，主要从事神经血管病的研究。

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6358-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.018