蛹虫草抑制NF-κB p65表达对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

闫魏魏　蔡　琦　逄　利　徐大海　王少坤　张　楠　吴　扬

(吉林大学第一医院急诊内科，吉林　长春　130021)



蛹虫草抑制NF-κB p65表达对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

闫魏魏蔡琦逄利徐大海王少坤张楠吴扬

(吉林大学第一医院急诊内科，吉林长春130021)

〔摘要〕目的探讨蛹虫草通过抑制核转录因子p65(NF-κB p65)表达对脑缺血再灌注损伤的保护机制。方法健康成年大鼠分成正常对照组(C组)、缺血再灌注组(I/R组)、蛹虫草低剂量治疗组(250 mg/kg)、蛹虫草高剂量治疗组(500 mg/kg)，再灌注48 h后采用免疫印迹法测NF-κB p65蛋白表达水平，采用免疫组化检测海马组织中突触素阳性细胞，苏木素-伊红染色(HE)法观察大鼠海马组织病理变化，酶联免疫吸附(ELISA)法检测海马组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α和白介素(IL)-10含量。结果I/R组大鼠海马组织损伤明显，NF-κB p65蛋白、TNF-α的表达明显增多，突触素阳性细胞及IL-10表达明显下降，与其他组比较差异显著(P<0.05)，蛹虫草高剂量治疗组其NF-κB p65蛋白、TNF-α的表达均下降，而突触素阳性细胞及IL-10表达明显升高，与I/R组比较差异明显(P<0.05)，与HE法观察海马组织结果相一致。结论蛹虫草可抑制NF-κB p65表达的活化和表达，减轻脑缺血再灌注损伤。

〔关键词〕蛹虫草；核转录因子p65表达；脑缺血再灌注；脑保护

第一作者：闫魏魏(1989-)，男，硕士，主要从危重症的治疗研究。

蛹虫草具有抗感染、抗氧化、抑制炎症反应、清除自由基、增强免疫力、抗凋亡、抗疲劳等作用〔1〕。多种研究表明其具有清除自由基及抑制炎性介质释放等作用。在脑缺血再灌注损伤后复杂的病理生理机制中，炎症反应、氧自由基损伤是导致脑缺血再灌注后神经功能损伤的主要原因，是目前急危重症医学研究中的热点，抗氧化应激损伤、减轻炎症反应也成为治疗缺血性脑血管疾病的重要途径〔2～6〕。本研究旨在观察蛹虫草通过抑制核转录因子(NF-κB)p65的活化和表达，对脑缺血再灌注损伤的脑保护作用。

1材料与方法

1.1试验动物和主要试剂健康成年雄性大鼠(吉林大学动物实验中心)；酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(上海信然生物公司)；突触素测定试剂盒(Nenmarkers公司)；NF-κB p65、Lamin抗体(上海通派科技)；蛹虫草(吉林省蚕业科学研究所，60℃烘干、含水量<1.0%、磨粉过100目筛)。

1.2分组对照组(C组)：进行假手术操作，未使用线栓法建立脑缺血再灌注模型；缺血再灌注组(I/R组)：线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，给予等量生理盐水灌胃；蛹虫草低剂量治疗组(L-cordyceps组)：线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，蛹虫草溶液250 mg/kg灌胃；蛹虫草高剂量治疗组(H-cordyceps组)：线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，蛹虫草溶液500 mg/kg灌胃。

1.3动物模型的建立除C组外，脑缺血再灌注大鼠模型均按制作方法〔7〕获得，接受脑缺血2 h和再灌注48 h的处理。

1.4免疫印迹法用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，充分暴露大鼠心脏及主动脉弓并留置输液针，将右心耳剪开，用生理盐水快速灌洗后再用4%的多聚甲醛灌流内固定，直到流液透明，断头取脑，切取右侧大脑半球距嗅球尖端7～11 mm，厚约2 mm的冠状脑组织，将标本保存于液氮中。取液氮中保存的脑组织标本，于4℃解冻后称重，每20 mg组织加入150～250 μl裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，充分裂解后，10 000～14 000 r/min离心3～5 min，取上清，测定蛋白的浓度，将40 μg等蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，湿转至硝酸纤维素(NC)膜，经3%牛血清蛋白(BSA)封闭并摇床后3 h，加入1∶2 000稀释的抗体，4℃过夜，用Washing Buffer洗膜3次，5 min/闪，再加入1∶10 000稀释的碱性磷酸酶标记二抗后室温摇床2 h，再次用Washing Buffer洗膜5次，3 min/次，然后用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/硝基四氮唑蓝(NBT/BCIP)显色，结果用图像处理仪处理并得出吸光度(A)值，目标蛋白的表达水平以“NF-κB p65/内参(β-actin)”的吸光度值比率计算。

1.5免疫组化新鲜海马组织取出进行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、组织石蜡包埋，连续切片，厚度为5 μm，制成载玻片标本，切片常规脱蜡至水，高温高压抗原修复，山羊血清封闭37℃，30 min，一抗4℃过夜，二抗37℃，30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，常规复染封片，在光镜下观察并用图像分析仪检测突触素反应产物的光密度值，以代表突触素的量。

1.6苏木素-伊红(HE)染色将海马组织切片脱蜡至水，常规HE，透明，封片，于光镜下观察海马组织结构。

1.7ELISA取新鲜海马组织ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-10的水平，严格按照说明书进行。

1.8统计学方法采用SPSS13.0软件进行方差分析。

2结果

2.1免疫印迹法与C组(0.21±0.02)相比，I/R组NF-κB p65蛋白表达水平(0.56±0.10)显著升高；蛹虫草高、低剂量组可抑制脑缺血再灌注损伤导致的NF-κB p65蛋白表达水平，其中H-cordyceps组(0.31±0.05)与I/R组相比具有显著差异(P<0.01)，而L-cordyceps组(0.50±0.15)与I/R组相比并无显著差别(P=0.13)。见图1。

2.2大鼠海马CA1区突触素阳性细胞的分布大鼠脑组织切片进行突触素免疫组织化学染色，结果发现突触素阳性细胞在各组海马CA1区的锥体层和颗粒层均有分布，I/R组突触素表达的阳性率(90±26)低于C组(232±14)(P<0.01)；H-cordyceps组(173±30)与I/R组相比差异显著(P<0.01)，而L-cordyceps组(101±17)(P=0.10)与I/R组相比并无显著差别(P>0.05)。见图2。

图1　各组NF-κB p65表达水平

图2　各组中突触素阳性细胞分布

2.3HE染色光镜下观察，C组大鼠海马CA1区可见3～4层排列紧密的锥体细胞，结构较完整，胞体大且染色均一，细胞核大而圆，核仁清晰可见。I/R组海马区可见变形肿胀的锥体细胞，细胞层次较C组明显减少，细胞带排列紊乱，细胞间隙增宽，可见脱失和胶质化现象，胞核深染且体积减小，结构不清，可见明显呈多角形或三角形的核固缩现象，外周见星形胶质细胞聚集，其细胞核明显肿大、淡染。H-cordyceps组海马CA1区结构比较完整，可见3～4层排列整齐的锥体细胞，呈圆形，核仁清晰可见，细胞脱失和胶质化现象较模型组减少，胶质细胞增生明显减轻。见图3。

图3　各组海马组织HE染色

2.4ELISA 法测定海马TNF-α和IL-10的含量I/R组大鼠脑组织匀浆中TNF-α含量(28.86±1.93)较C组(10.96±1.96)明显增加；与I/R组比较，L-cordyceps组(25.44±2.94)可减少脑组织匀浆中的TNF-α含量，但无统计学意义(P>0.05)；而H-cordyceps组大鼠脑组织匀浆中的TNF-α的水平(25.46±1.17)显著降低(P<0.05)。I/R组大鼠脑组织匀浆中IL-10含量(7.11±0.47)同C组(3.07±0.55)比较显著增加；与I/R组比较，L-cordyceps组可升高脑组织内IL-10含量(6.76±0.86)，但无统计学意义(P>0.05)；H-cordyceps组可明显升高脑组织内IL-10含量(8.84±0.53)(P<0.05)。

3讨论

研究发现，脑缺血缺氧使神经细胞产生损伤是一个快速的级联反应，包括许多重要环节，其中炎性损伤是脑缺血再灌注神经系统损伤的重要机制之一，炎性瀑布反应触发后可以加剧脑损伤的发展。NF-κB是JAK/STAT信号的下游分子，参与控制DNA的转录和细胞对外源性刺激的应答反应，如应激、细胞因子、自由基、紫外线、过氧化脂质以及细菌和病毒感染等〔8〕。NF-κB p65的活化及移位可导致下游多种细胞因子如TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，这些细胞因子参与了脑缺血损伤所导致的神经系统损伤，提示上述细胞因子可能成为减轻脑缺血再灌注后神经系统损伤的新靶点。

蛹虫草是我国名贵中药，具有很高的食用和药用价值。本研究说明蛹虫草对NF-κB表达具有阻断作用，高剂量蛹虫草可通过减少大脑组织中TNF-α的含量从而减轻脑缺血再灌注后的炎症损伤，发挥对脑组织及神经功能的保护作用。而IL-10是重要的抗炎细胞因子，能抑制单核-巨噬细胞等的活性，降低细胞炎症因子对平滑肌细胞增殖的刺激作用，导致细胞间黏附分子表达和活性的下调，从而抑制TNF-α和一氧化氮(NO)的表达〔9〕，抑制白细胞聚集发挥其抗感染效应以保护神经系统功能。本研究说明蛹虫草具有抑制脑缺血再灌注后炎症反应作用，这与大鼠海马组织形态学变化及免疫组化结果相一致，显示了蛹虫草可抑制NF-κB p65的活化和表达，从而减轻脑缺血再灌注后神经系统的损伤。

4参考文献

1马艳，汪宇，康万军，等.蛹虫草口服液对小鼠耐缺氧和抗疲劳作用〔J〕.中国药师，2012；15(10)：1375-7.

2Detre JA，Wang J，Wang Z，etal.Arterial spin-labeled perfusion MRI in basic and clinical neuroscience〔J〕.Curr Opin Neurol，2009；22(4)：348-55.

3Abu-Jawdeh BG，Kanso AA，Schelling JR.Evidence-based approach for prevention of radiocontrast-induced nephropathy〔J〕.J Hosp Med，2009；4(8)：500-6.

4Mirasol RV，Bokkers RP，Hernandez DA，etal.Assessing reperfusion with whole-brain arterial spin labeling：a noninvasive alternative to gadolinium〔J〕.Stroke，2014；45(2)：456-61.

5Eilaghi A，Brooks J，D'Esterre C，etal.Reperfusion is a stronger predictor of good clinical outcome than recanalization in ischemic stroke〔J〕.Radiology，2013；269(1)：240-8.

6Ashburner J，Friston KJ.Voxel-based morphometry the methods〔J〕.Neuroimage，2000；11(6 Pt 1)：805-21.

7Longa EZ，Weinstein PR，Calson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

8Ford AL，An H，D'Angelo G，etal.Preexisting statin use is associated with greater reperfusion in hyperacute ischemic stroke〔J〕.Stroke，2011；42(5)：1307-13.

9Thom SR，Bhopale VM，Fisher D，etal.Delayed neuropathology after carbon monoxide poisoning is immune-mediated〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2004；101(37)：13660-5.

〔2015-03-25修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：吴扬 (1960-)，女，教授，主要从事危重症及中毒研究。

基金项目：吉林省科技发展计划重点科技攻关项目(No.20130206063YY，20140204054YY)；长春市科技计划社会发展项目(No.12SF47)

〔中图分类号〕R743

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6333-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.006