慢病毒介导的CDK2-shRNA促进黑色素瘤细胞A375凋亡

刘厚广　刘　卓　姜　颖　肖井仁　李红影　李　峥　霍姗姗　于英君

(福建中医药大学附属厦门市第三医院皮肤科，福建　厦门　361100)



慢病毒介导的CDK2-shRNA促进黑色素瘤细胞A375凋亡

刘厚广刘卓1姜颖2肖井仁2李红影2李峥霍姗姗于英君2

(福建中医药大学附属厦门市第三医院皮肤科，福建厦门361100)

〔摘要〕目的探讨慢病毒介导的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2-shRNA对人黑色素瘤细胞A375凋亡的影响。方法依据CDK2基因序列，设计3条靶向干扰CDK2的序列，构建CDK2-shRNA慢病毒载体，质粒转染人胚肾细胞株(HEK293)细胞进行慢病毒包装，滴度测定包装的重组pGMLV-CDK2-shRNA慢病毒，免疫印迹检测对CDK2的干扰效率及对细胞周期蛋白(cyclin)E、E2F1、RB蛋白表达的影响，四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)检测细胞增殖活力，Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测A375凋亡的发生。结果成功获得包装的重组pGMLV-CDK2-shRNA慢病毒，病毒滴度为5×108TU/ml。重组的pGMLV-CDK2-shRNA慢病毒能有效下调CDK2、cyclinE、E2F1蛋白表达，抑制A375细胞增殖和触发凋亡。结论基于慢病毒介导的CDK2-shRNA能够促进黑色素瘤细胞A375凋亡发生，为黑色素瘤的基因治疗提供理论支撑。

〔关键词〕黑色素瘤；细胞周期蛋白依赖性激酶；慢病毒载体；凋亡

1吉林大学中日联谊医院普通外科

2黑龙江中医药大学生化教研室

第一作者：刘厚广(1976-)，男，博士，主治医师，主要从事皮肤肿瘤的分子生物学研究。

黑色素瘤的发病率在全球范围内呈现递增趋势〔1〕。浅表扩散性黑色素瘤(SSM)、恶性雀斑样痣黑色素瘤(LMM)、结节性黑色素瘤(NM)和肢端雀斑样痣型黑色素瘤(ALM)为目前严重威胁人类生命健康的黑色素瘤〔2〕。细胞周期蛋白(cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKIs)共同调控着细胞周期的有序运行。已有研究表明CDK2在原发性和转移性黑色素中高表达，同时CDK2也调控着黑色素瘤细胞由G1期向S期的转变〔3〕。本文通过慢病毒介导的CDK2-shRNA研究对人黑色素瘤细胞株(A375细胞)增殖和凋亡的影响。

1材料与方法

1.1材料pGMLV-SC5慢病毒载体(吉满生物)；黑色素瘤细胞A375、人胚肾细胞株(HEK293T)为本实验室保存；BamHI、EcoRI、T4 DNA连接酶(Fermentas)；PCR胶回收试剂盒(宝生物)；Dpα感受态(天根生物)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；CDK2、cyclinE、E2F1、RB、actin(CST)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(碧云天)；梓根过氧化物酶(HRP)标记对应源性IgG(北京博奥森)；聚偏氟丙烯(PVDF)膜(Pall公司)；电化学发光法(ECL)发光液(Thermo)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(天根生物)。

1.2CDK2-shRNA靶序列设计及重组CDK2-shRNA慢病毒载体构建依据公布的人CDK2基因序列，设计3条RNA干扰靶点序列(CCTGTTCGTACTTACACCCAT；GCCTGATTACAAGCCAAGTTT；CCTCAGAATCTGCTTATTAAC)，化学合成3对含有BamHI和EcoRI酶切位点互补的单链RNA干扰、退火形成3条双链的shRNA、BamHI和EcoRI酶切pGMLV-SC5慢病毒载体和双链shRNA，胶回收酶切产物，T4 DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化至Dpα感受态，挑取单克隆菌落进行摇菌并提取质粒进行序列测定。

1.3重组CDK2-shRNA慢病毒包装及滴度测定转染前1 d将生长状态良好的HEK293T细胞消化接种至10 cm细胞培养皿中，待细胞生长至70%～80%时进行质粒转染，按照每个10 cm细胞培养皿转染10 μg CDK2-shRNA重组质粒配置转染复合物，室温静置15～20 min后进行细胞转染，转染18～20 h后去除含有转染复合物的细胞上清，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后添加15 ml新鲜DMEM培养基继续培养，48 h后收集细胞上清至50 ml离心管中，4 500 r/min、4℃离心5 min，离心后上清进行0.45 μm滤膜过滤，将滤液分批转移至centrifugal filter装置中4 500 r/min、4℃离心10 min，待所有滤液转移完毕后4 500 r/min、4℃离心20 min，过滤装置上层存留液体极为浓缩的重组CDK2-shRNA慢病毒，分装后-80℃保存重组慢病毒。将获得的重组CDK2-shRNA慢病毒进行10倍梯度稀释，将梯度稀释液接种至96孔板，每孔接种90 μl梯度稀释的重组CDK2-shRNA慢病毒，每个稀释梯度接种8个复孔，37℃培养，待接种第3天去除含重组CDK2-shRNA慢病毒的培养基，加入100 μl新鲜培养基，第5～6天荧光显微镜观察每孔荧光细胞数量，计算重组CDK2-shRNA慢病毒病毒滴度。

1.4重组CDK2-shRNA慢病毒对黑色素瘤细胞A375增殖的影响选取包装成功的其中一个重组慢病毒进行如下实验，以未感染重组CDK2-shRNA慢病毒的黑色素瘤细胞A375为正常细胞对照组，以含有CDK2阴性对照的CDK2-shRNA-NC重组慢病毒感染为阴性对照组，以CDK2-shRNA重组慢病毒为实验组感染人黑色素瘤细胞A375，分别于感染后24、48、72 h按照四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)检测细胞增殖的方法检测A375的增殖情况。

1.5重组CDK2-shRNA慢病毒对黑色素瘤细胞A375细胞周期相关蛋白的影响依照上述实验分组，提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离不同分子量的蛋白，用含有20%甲醇的转膜液100 V转膜60 min，将蛋白转移至PVDF膜，Tris盐酸缓冲液(TBST)清洗PVDF膜5 min后用含有5%胎牛血清(BSA)的TBST封闭液室温封闭1 h，用5%BSA的TBST按照1∶1 000的稀释比例稀释CDK2、cyclinE、E2F1、RB抗体，4℃孵育过夜。TBST清洗3次完成后HRP标记的IgG二抗室温孵育1 h、TBST清洗3次完成后、ECL发光液进行发光、暗室内进行显影和定影。

1.6Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡依照上述实验分组，重组CDK2-shRNA慢病毒感染人黑色素瘤细胞A375 48 h后，PBS清洗细胞3次，胰酶消化后添加适量PBS终止胰酶消化，1 200 r/min离心5 min收集细胞，PBS重悬细胞并计数，取含有5～10万个细胞的细胞悬液，1 200 r/min离心5 min收集细胞，向细胞沉淀中加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC轻轻混匀，加入10 μl碘化吖啶(PI)染色液轻轻混匀，室温避光孵育10～20 min，随后置于冰浴中，染色完成后流式细胞仪检查荧光信号强度。

1.7统计学方法采用SPSS13.0进行t检验。

2结果

2.1重组CDK2-shRNA慢病毒构建成功并显著降低CDK2蛋白的表达依据CDK2基因设计的3条shRNA干扰靶序列经克隆、测序、细胞转染和病毒包装，荧光显微镜检查3个重组慢病毒均有较强的绿色荧光，因此将包装成功的含有CDK2-shRNA的重组慢病毒分别命名为重组pGMLV-CDK2-shRNA1、pGMLV-CDK2-shRNA2、pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒(图1A)。病毒滴度测定结果显示3个重组慢病毒的病毒滴度均为5×108TU/ml。免疫印迹检测结果显示3个重组慢病毒均可显著降低CDK2蛋白的表达，重组pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒抑制CDK2蛋白表达的效果更为显著(图1B)。

2.2重组pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒抑制黑色素瘤细胞A375的增殖重组pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒可抑制人黑色素瘤细胞A375的增殖，且抑制效应具有明显的时间依赖性。免疫印迹检测结果显示重组pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒可有效降低cyclinE、E2F1蛋白的翻译水平，然而并未提高RB蛋白的翻译水平，见图2，表1。

图1　CDK2-shRNA重组慢病毒鉴定及CDK2蛋白表达的免疫印迹检测

图2　重组pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒抑制A375的增殖

时间A375shRNA-NCshRNA324h1.035±0.0121.005±0.0090.887±0.02948h1.247±0.0051.055±0.0090.900±0.01372h1.416±0.0071.330±0.0080.931±0.005

2.3重组pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒促进人黑色素瘤细胞A375凋亡发生A375细胞对照组仅有1.2%的早期凋亡细胞；重组pGMLV-CDK2-NC慢病毒感染A375后，有4.1%的细胞发生早期凋亡，1.8%细胞为晚期凋亡细胞；重组pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒感染A375细胞后，凋亡早期的细胞比例提升至16.6%，凋亡晚期的细胞比例提升至7.8%，A375细胞发生明显的凋亡。

3讨论

遗传因素和外界诸如紫外线照射等均可引起人类黑色素瘤的发生〔4〕。然而细胞周期调控的紊乱是引起肿瘤发生的根本因素。正常的细胞周期缺失任何一个节点都会导致细胞增殖紊乱、基因组不稳定和癌症生产〔5，6〕。细胞收到有丝分裂刺激后，细胞从静止期G0期释放；G1期早期cyclinD开始表达并活化CDK4、CDK6，cyclinD-CDK4/6复合物启动RB家族成员磷酸化，磷酸化完成后RB释放E2F转录子起始诸如CCNE1基于转录，使细胞通过限制节点。G1期晚期，cyclinE-CDK2复合物磷酸化RB的另一磷酸化位点，E2F诱导DNA复制所需要的蛋白表达，而cyclinA-CDK2复合物维持RB蛋白的磷酸化状态〔7〕。CDK2是一种Ser/Thr蛋白激酶，编码298个氨基酸，分子量为34 kD〔8〕。CDK2单体不具有激酶活力，需与其调节配体分子cyclinE或cyclinA非共价结合形成异源二聚体复合物才可被活化〔9〕。已有研究表明CDK2与黑色素瘤的发展和进展有关，CDK2在原发性和转移性黑色素瘤组织中呈现高表达，但正常的痣和原位黑色素瘤中表达正常〔3〕。目前关于黑色素瘤的治疗主要包括外科治疗和化学药物治疗，靶向CDK2的抑制剂也有报道〔10〕。随着分子生物学技术的发展，基因治疗成为一种新型的治疗措施。

4参考文献

1Bishop JN,Bataille V,Gavin A,etal.The prevention,diagnosis,referral and management of melanoma of the skin:concise guidelines〔J〕.Clin Med,2007;7(3):283-90.

2Mccourt C,Dolan O,Gormley G.Malignant melanoma:a pictorial review〔J〕.Ulster Med J,2014;83(2):103-10.

3Abdullah C,Wang X,Becker D.Expression analysis and molecular targeting of cyclin-dependent kinases in advanced melanoma〔J〕.Cell Cycle,2011;10(6):977-88.

4Mouret S,Forestier A,Douki T.The specificity of UVA-induced DNA damage in human melanocytes〔J〕.Photochem Photobiol Sci,2012;11(1):155-62.

5Malumbres M,Barbacid M.To cycle or not to cycle:a critical decision in cancer〔J〕.Nat Rev Cancer,2001;1(3):222-31.

6Malumbres M,Barbacid M.Cell cycle,CDKs and cancer:a changing paradigm〔J〕.Nat Rev Cancer,2009;9(3):153-66.

7Lapenna S,Giordano A.Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2009;8(7):547-66.

8Tsai LH,Harlow E,Meyerson M.Isolation of the human CDK2 gene that encodes the cyclin A-and adenovirus E1A-associated p33 kinase〔J〕.Nature,1991;353(6340):174-7.

9Malumbres M,Barbacid M.Cell cycle kinases in cancer〔J〕.Curr Opin Genet Dev,2007;17(1):60-5.

10Cuomo ME,Platt GM,Pearl LH,etal.Cyclin-cyclin-dependent kinase regulatory response is linked to substrate recognition〔J〕.J Biol Chem,2011;286(11):9713-25.

〔2015-03-26修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

基金项目：厦门市卫生局资助项目(No.3502Z20130190)；厦门市同安区科技局资助项目(No.20120081)

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6345-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.012