一测多评法测定丹参中多种指标成分的含量

张　晨　邱　实　张彦飞　贡济宇

(长春中医药大学，吉林　长春　130117)



一测多评法测定丹参中多种指标成分的含量

张晨邱实张彦飞贡济宇

(长春中医药大学，吉林长春130117)

摘要〔〕目的采用一测多评法同步测定丹参中5个主要成分的含量,为控制丹参药材的质量提供方法。方法用超高效液相色谱法对丹参药材进行分析，获得丹参药材的UHPLC色谱图与相关数据；运用一测多评方法(SSDMC)，同时对丹参药材中5种成分进行定量分析。结果对丹参药材所建立的含量测定方法可在15 min内完成对其5个指标性成分的精确定量分析；且使用一测多评方法仅需要一个成分的标准品，即可进行定量分析。方法学考察结果均符合中药质量标准研究制定技术要求。结论该研究建立了丹参药材的UHPLC含量测定方法，从含量测定方面控制丹参药材的质量。该研究建立的丹参含量测定方法简单、快速、稳定且成本低廉。

关键词〔〕一测多评法；超高效液相色谱；丹参；含量测定；中药质量控制

第一作者：张晨(1987-)，女，硕士，主要从事药物分析研究。

丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效，用于月经不调、经闭痛经、疮疡肿痛、心烦不眠、心绞痛等。丹参的有效成分分为脂溶性的二萜类成分和水溶性的酚酸类成分，中药的多成分、多功效作用特点，决定着单一成分难以表达中药质量〔1〕。近年来关于丹参水溶性成分及脂溶性成分含量测定的报道较多。但是这种多成分定量方法存在着对照品消耗量大，而且操作复杂、繁琐的缺陷。对照品供应短缺限制了这些方法在科研、实际生产、市场监督中的应用。“一测多评”方法的出现，在一定程度上解决了之前所遇到的难题。本实验应用此方法展开丹参多指标多类成分质量控制的研究设想。即只测定其中1个脂溶性成分“丹参酮ⅡA”，通过建立该成分与其他成分的校正因子，同时计算3个脂溶性与3个水溶性成分的含量〔2～5〕。

1仪器与试剂

超高效液相色谱系统：Agilent 1290美国安捷伦科技公司〔配置高性能自动进样器(G4226A)，二元泵(G4220A)，柱温箱(G1316C)，可变波长检测器(DAD G4212A)，Agilent ChemStationB.04.03版色谱工作站〕；BRANSON B3500S-DTH超声波清洗仪，荷兰必能信有限公司；Sartorius CP124S电子天平，北京赛多利斯有限公司；电子天平：Sartorius BT25S 北京赛多利斯有限公司。乙腈，磷酸为色谱纯；丹参药材购买于山东平邑；迷迭香酸对照品，紫草酸对照品购买于上海友思生物技术公司；丹酚酸B对照品：上海诗丹德生物技术有限公司(批号：STA-00511002)；丹参酮ⅡA对照品(批号：110766-200619)，隐丹参酮对照品(批号：110852-200806)，丹参酮Ⅰ对照品(批号：110867-200406)，均购买于中国药品生物制品检定所，超纯水。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX Extend C18(2.1×100 mm，1.8 μm)；Agilent 1290 online-filter。流动相：乙腈(A)-0.05%磷酸(v/v)(B)；流速：0.4 ml/min；检测波长：270 nm(4 nm)(参比波长:无)；进样体积：2 μl；柱温：25℃；采样频率：40 Hz。上述色谱条件下,各组分分离度良好,见表1，图1。

表1梯度程序

时间(min)A(%)B(%)洗脱0~516~2784~73线性梯度5~627~6073~40线性梯度6~1260~6240~38线性梯度12~1562~7038~30线性梯度

1：迷迭香酸;2：紫草酸;3：丹酚酸B;4：隐丹参酮;5：丹参酮I;6：丹参酮ⅡA;7：未知峰 (1～6为所测成分)图1　丹参样品色谱图

2.2检测波长的选择丹酚酸B与丹参酮ⅡA含量较高，且含量稳定，都可作为一测多评方法的对照品。但考虑到丹酚酸B对照品价格昂贵，且热稳定性差，所以选取价格低廉，且稳定性好，色谱峰左右均无杂质峰的丹参酮ⅡA作为一测对照品，选取丹参酮ⅡA的最大吸收波长270 nm作为检测波长。

2.3对照品溶液的制备对照品贮备液的配制：精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ对照品及丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，置10 ml棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml含迷迭香酸0.038 5 mg，含紫草酸0.076 0 mg，含丹酚酸B 0.903 0 mg，含隐丹参酮0.042 5 mg，丹参酮Ⅰ0.019 6 mg，丹参酮ⅡA 0.053 9 mg的溶液，即得。

2.4供试品溶液的制备取本品粉末(过五号筛)约0.15 g，精密称定，置50 ml离心管中，精密加入甲醇15 ml，摇匀，超声10 min，4 000 r/min离心5 min，倾出上清液至50 ml量瓶，药渣继续加入甲醇10 m，摇匀，超声10 min，4 000 r/min离心5 min，倾出上清液至同一50 ml量瓶，重复提取3次；加甲醇溶液至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，弃去2 ml初滤液，即得。

2.5方法学考察

2.5.1线性及线性范围对照品溶液的制备：精密量取0.05、 0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml对照品贮备液，置于5 ml量瓶中，加甲醇溶剂稀释至刻度。分别精密吸取各对照品溶液各2 μl，注入超高效液相色谱仪，按确立的色谱条件进行测定，记录各峰峰面积。以对照品浓度(mg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，以最小二乘法进行线性回归。见表2。

表25个指标成分的线性及线性范围

名称R线性范围(μg)残差平方和F(校正因子)迷迭香酸0.99990.00770~0.03851.3725.64紫草酸0.99990.00152~0.07602.8317.44丹酚酸B0.99990.0181~0.903560.2626.93隐丹参酮0.99990.000849~0.042529.6831.15丹参酮Ⅰ0.99990.000391~0.01964.8701.43丹参酮ⅡA1.00000.00108~0.053930.5651.00

2.5.2精密度实验按供试品溶液制备方法，每天制备3份供试品溶液，连续分析3 d，得出迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ及丹参酮ⅡA的日间精密度RSD为1.02%、0.87%、0.85%、0.89%、0.98%和0.75%，且外标法与一测多评法的重复性精密度RSD一致，表明仪器精密度良好。

按供试品溶液制备方法，分别采用不同安捷伦超高效液相色谱系统，每个条件分析3份供试品溶液，得出迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ及丹参酮ⅡA的日间精密度RSD为1.02%、0.87%、0.85%、0.89%、0.98%和0.75%，且外标法与一测多评法的重复性精密度RSD一致，表明仪器精密度良好。

2.5.3稳定性实验供试品溶液在室温条件下放置 0、4、8、12、24 h后，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ及丹参酮ⅡA的峰面积的RSD分别为1.32%、0.60%、0.62%、1.71%、1.14%和0.73%，表明处理后的样品在24 h内稳定。

2.5.4重复性试验采用3个不同浓度(高、中、低)，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，连续进样6次，测定，得出迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ及丹参酮ⅡA重复性的平均RSD分别为1.44%、0.59%、0.62%、0.87%、0.72%和0.65%，且外标法与一测多评法的重复性RSD一致，表明该方法的重复性好。

2.5.5加样回收率按供试品溶液制备方法，制备9份供试品。称取0.075 g丹参粉末，精密称定，置50 ml具塞锥形瓶中，分别称取2.26、4.52、6.78 mg丹酚酸B相当于供试品溶液中丹酚酸B含量的50%、100%、150%，分别精密加入相当于供试品溶液中迷迭香酸、紫草酸、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮ⅡA含量50%、100%和150%相应的混合对照品溶液15 ml，按供试品溶液制备方法制备，每个浓度制备3份，共9份供试品溶液。分别吸取2 μl注入超高效液相色谱仪，记录峰面积，计算迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量。见表3。

表3加样回收率试验结果(n=3)

名称水平外标法(%)一测多评(%)RSD(%)迷迭香酸低97.5695.991.42中97.3196.271.41高99.0598.180.59紫草酸低99.50100.621.24中100.29101.050.68高100.90101.530.14丹酚酸B低99.2695.280.23中100.7198.110.98高101.9199.710.79隐丹参酮低98.9198.381.49中101.36101.000.67高100.87100.570.61丹参酮Ⅰ低89.2157.180.91中83.1763.171.08高85.0368.720.50丹参酮ⅡA低96.9596.951.20中100.93100.930.46高100.75100.750.53

2.5.6校正因子计算采用独立一次配制的8个系列混合对照品溶液的峰面积和相应浓度计算一测多评法中的校正因子，采用丹参酮ⅡA作为一测对照品(SSDMC)，从标准曲线中算得各对照品溶液斜率，校正因子通过斜率值算出，公式如下：Fi=SlopeⅡA/Slopei,Fi：校正因子(迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ)，SlopeⅡA：斜率值(丹参酮IIA-SSDMC)。Slopei：斜率值(迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ)。

2.6丹参含量测定见表4。

表4药材含量测定试验结果(n=3)

名称外标法水平称样量(g)含量(%)RSD(%)一测多评法水平称样量(g)含量(%)RSD(%)迷迭香酸低0.07530.2661.52低0.07530.2681.52中0.14990.2590.80中0.14990.2610.80高0.22450.2571.99高0.22450.2591.99平均值0.14990.2611.44平均值0.14990.2631.44紫草酸低0.07530.4630.25低0.07530.4700.25中0.14990.4600.06中0.14990.4670.06高0.22450.4551.46高0.22450.4631.46

续表4药材含量测定试验结果(n=3)

名称外标法水平称样量(g)含量(%)RSD(%)一测多评法水平称样量(g)含量(%)RSD(%)平均值0.14990.4590.59平均值0.14990.4670.59丹酚酸B低0.07536.0900.31低0.07536.0220.31中0.14996.0200.17中0.14995.9540.17高0.22455.9681.40高0.22455.9021.40平均值0.14996.0260.62平均值0.14995.9600.62隐丹参酮低0.07530.2530.60低0.07530.2550.60中0.14990.2550.82中0.14990.2570.82高0.22450.2551.20高0.22450.2561.20平均值0.14990.2540.87平均值0.14990.2560.87丹参酮Ⅰ低0.07530.1250.63低0.07530.1140.63中0.14990.1330.40中0.14990.1210.40高0.22450.1371.14高0.22450.1251.14平均值0.14990.1320.72平均值0.14990.1200.72丹参酮ⅡA低0.07530.3290.53低0.07530.3290.53中0.14990.3320.35中0.14990.3320.35高0.22450.3321.09高0.22450.3321.09平均值0.14990.3310.65平均值0.14990.3310.65总含量低0.07537.5260.28低0.07537.4590.28中0.14997.4590.18中0.14997.3920.18高0.22457.4041.39高0.22457.3371.39平均值0.14997.4630.62平均值0.14997.3960.62

3讨论

有研究者对试验条件分别进行了考察：丹参酮Ⅰ对照品很难溶解于甲醇水溶液中，所以为后期实验考虑，采用甲醇作为提取溶剂；丹酚酸B成分在高温下不稳定，会产生一定程度的降解，所以选择超声提取法为供试品提取方法；在此基础上分别考察了提取溶剂体积，提取次数以及提取时间；流动相酸度流动相酸度可以在0.04%～0.06%调节，系统适用性参数受流动相酸度影响很小；降低流动相中乙腈比例，可以改善部分分离度。酚酸类成分在调整乙腈比例时，相对保留时间波动较大〔6～8〕超过2.0%；但含量合计的相对标准偏差小于2.0%，因此建议流动相中乙腈比例不宜变动过大；检测波长变动对相对保留时间，系统适用性参数影响很小；对一测多评含量影响较大。因此一测多评法中，应严格控制检测波长为270 nm；流速对含量影响较小，相对标准偏差小于2.0%。对系统适用性参数，降低与升高流速可以提高理论板数。流速对相对保留时间影响较大，相对标准偏差超过2.0%。因此一测多评法中，应当控制流速；柱温对相对保留时间有较大影响，RSD较大；对含量无影响，相对标准偏差小于2.0%。

对于一测多评法，检测波长，流动相比例，柱温和流速应与标准设定一致。流动相酸度，进样体积、梯度时间可以适当调整，以改善系统适用性参数〔9〕。

基于耐用性结果：系统适用性参数应确定为重复进样的RSD小于2.0%；迷迭香酸与紫草酸，隐丹参酮与其前一个杂质峰，隐丹参酮与丹参酮Ⅰ的分离度不小于1.5；对称因子大于0.5，小于1.5；丹参酮ⅡA理论板数应大于70 000。

将“一测多评”法用于含迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ及丹参酮ⅡA成分的多指标质量评价，通过大量的实验建立了6种指标性成分间的相对校正因子，对“一测多评”法的药材质量评价方式进行了探索性研究，结果证明采用“一测多评”法建立主要成分之间的相对校正因子对药材质量进行准确、经济的控制是可行的。

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9王智民，钱忠直，张启伟，等.一测多评法建立的技术指南〔J〕.中国中药杂志，2011;36(6):657.

〔2015-02-11修回〕

(编辑曲莉)

通讯作者：贡济宇(1960-)，女，教授，主要从事药物分析研究。

基金项目：吉林省科技发展计划项目(20130727020YY)

中图分类号〔〕R917〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7015-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.022