心外膜脂肪细胞核因子-κB信号途径抑制在抗动脉粥样硬化中的作用

邢　杰

(海南省人民医院心脏外科，海南　海口　570311)



心外膜脂肪细胞核因子-κB信号途径抑制在抗动脉粥样硬化中的作用

邢杰

(海南省人民医院心脏外科，海南海口570311)

摘要〔〕目的研究心外膜脂肪细胞核因子(NF)-κB信号途径抑制在抗动脉粥样硬化中的作用。方法建立泡沫细胞模型，分为空白组，转染试剂组，siRNA干扰组，高脂组，高脂+SRT1720组，高脂+SRT1720+siRNA干扰组。采用油红O染色判断模型的建立，采用Western印迹方法进行蛋白表达的分析。结果建立模型成功；与高脂组比较，高脂+SRT1720组SIRT1蛋白表达量升高显著，NF-κB及其下游靶分子肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白表达量下降显著(P<0.05)。与高脂+SRT1720组比较，高脂+SRT1720+siRNA干扰组SIRT 1蛋白表达量下降显著，NF-κB及其下游靶分子TNF-α蛋白表达量升高显著(均P<0.05)。结论泡沫细胞中SIRT1 是 NF-κB信号通路的上游，通过抑制心外膜脂肪组织NF-κB炎症信号途径，参与调节泡沫细胞从动脉粥样硬化斑块中移出，可为防治冠状动脉粥样硬化的治疗提供新的手段。

关键词〔〕NF-κB信号途径；心外膜脂肪细胞；抗动脉粥样硬化；沉默信息调节因子(SIRT)1

第一作者：邢杰(1965-)，男，副主任医师，主要从事先天性心脏病、心脏瓣膜病，冠心病及大血管病研究。

心外膜脂肪一般来讲是指在心外膜及心肌外表面间的脂肪组织，在人类的心脏外膜覆盖。与其他白色脂肪组织不一样，心外膜脂肪组织的生理功能多样，作为多种炎性介质的来源，其不仅能够作为脂质的储存库，还发挥内分泌的作用，通过分泌趋化因子、细胞因子、激素等来维持机体的正常功能〔1,2〕。动脉粥样硬化(AS)是一个炎症反应性的慢性病程，患者血管中的单核细胞在各种黏附分子的作用下附着在血管内壁，使得单核细胞趋化因子(MCP)-1与其受体2相结合，加速单核细胞转化为巨噬细胞的速度，最终导致巨噬细胞过多地集聚在动脉粥样斑块的中心，并发展为凋亡而引发坏死脂核〔3,4〕。冠状动脉粥样硬化患者心外膜脂肪致炎因子分泌水平升高，抗炎因子分泌水平降低，过多分泌的致炎因子利用内分泌、旁分泌通路来作用于心肌及冠状动脉，加速冠状动脉病变的形成及发展〔5〕。因此从炎症信号途径出发，探讨通过调控心外膜脂肪的炎症来防治冠状动脉粥样硬化意义重大。本研究探讨心外膜脂肪细胞核因子(NF)-κB信号途径抑制在抗AS中的作用。

1资料与方法

1.1仪器与试剂荧光显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司)、全自动生化分析仪(日本OLYMPUS)。人单核细胞株U937购自美国Sciencell，沉默信息调节因子(SIRT)1激动剂、RPMI1640细胞培养基及胎牛血清购自美国GIBCO公司。 NF-κB，肿瘤坏死因子(TNF)-α购自美国Santa Cruz公司。

1.2建立泡沫细胞模型 在含有10%胎牛血清的高糖(约5.0 g/L) RPMI1640培养基中对人单核细胞系U937细胞进行培养，于5%CO2、37℃条件下的培养箱中放置12 h，加入链霉素(100 U/ml)和青霉素(100 mg/ml)，孵育12 h，进行巨噬细胞的诱导分化。另取对数生长期细胞，调整浓度至1×106个/ml，接种于6孔板上，每孔约1.5 ml，加终浓度为0.2 mmol/L的软脂酸钠、终浓度为0.08 g/L的ox-LDL，共同孵育24 h，建立诱导的泡沫细胞模型。

1.3实验分组分为空白组，转染试剂组，siRNA干扰组，高脂组，高脂+SRT1720组，高脂+SRT1720+siRNA干扰组。空白组细胞干预为于含高糖(约5.0 g/L) RPMI1640培养基中进行常规培养；转染试剂组是在空白组+5 μl的转染试剂；干扰组为转染试剂组+6 μmol/L的SIRT1干扰siRNA；高脂组为空白组+0.2 mmol/L的软脂酸钠+0.08 g/L的ox-LDL；高脂+SRT1720组为高脂组+5 μmol/L的SIRT1激动剂SRT1720；高脂+SRT1720+干扰组为高脂+SRT1720+6 μmol/L的SIRT1干扰siRNA。siRNA干扰操作过程参考说明书。

1.4油红O染色参照“1.2.1”中操作步骤，在细胞诱导为巨噬细胞的基础上进行细胞玻片制片，采用4%的多聚甲醛固定，行油红O染色。

1.5Western印迹分析蛋白表达采用4℃磷酸盐缓冲液洗细胞两次，1 min/次，加入放射免疫沉淀法(RIPA)细胞裂解液后，刮取相应细胞进行冰上裂解，约半小时后震荡，每5 min进行1次，后给予针头抽吸，每次1 ml左右，重复10次，4℃下12 000 r/min离心，离心30 min，吸上清液，采用二辛可宁酸(BCA)法测蛋白的浓度。并给予十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳试验，10%脱脂牛奶封闭60 min，抗体SIRT1以1∶500、NF-κB以1∶1 000、TNF-α以1∶500的比例在Tris-HCl缓冲盐溶液+Tween(TBST)中进行稀释，4℃下孕育24 h，TBST洗涤，共计3次，每次15 min；二抗以1∶5 000的比例，室温下放置1 h，TBST洗涤，共计3次，每次15 min。电化学发光(ECL)液发光，暗室中曝光，X线显影，采用Quantity One图像分析系统进行分析。

1.6统计学方法采用SPSS20.0统计软件进行t、χ2检验。

2结果

2.1U937巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立采用 PMA诱导U937单核细胞，24 h后发现，诱导下的细胞形态出现明显变化，大部分细胞呈梭形并紧贴壁生长，部分分化良好者出现伪足，此时提示单核细胞已分化为巨噬细胞，见图1。另在显微镜下观察，由于软脂酸钠及ox-LDL的作用，大部分细胞的细胞质内出现明显的红色脂质颗粒，与既定的泡沫细胞形态特点较为一致，见图2，提示建立模型成功。

2.2干扰siRNA对SIRT1的表达影响Western印迹检测表明，siRNA可明显降低SIRT1蛋白的表达水平，见图3。

2.3泡沫细胞模型中NF-κB信号途径及相关因子的Western印迹结果与高脂组比较，高脂+SRT1720组SIRT1蛋白表达量升高显著，NF-κB及其下游靶分子TNF-α蛋白表达量下降显著(均P<0.05 )。与高脂+SRT1720组比较，高脂+SRT1720+siRNA干扰组SIRT 1蛋白表达量下降显著，NF-κB及其下游靶分子TNF-α蛋白表达量升高显著(均P<0.05 )。见图4。

图1　巨噬细胞(×200)

图2　泡沫细胞(箭头处为典型改变，×200)

图3　干扰siRNA对SIRT1的表达影响

图4　泡沫细胞模型中NF-κB信号途径及相关因子的Western印迹结果

3讨论

AS是在遗传、环境等多种因素共同作用下所出现的一种慢性炎症反应性疾病，其发生的具体机制尚无统一的定论，多数观点认为其发生发展与内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、泡沫细胞及炎症反应的关系较为密切〔6,7〕。相关文献报道指出，内脏脂肪组织的功能不单局限于储存能量，还能够发挥内分泌的作用，通过分泌多种脂肪细胞因子来参与并促进AS发生及发展〔8〕。心外膜脂肪作为一个具有免疫活性的器官，参与冠脉周围炎症的发生。作为内脏脂肪组织的一部分，心外膜脂肪组织邻近冠脉，属于棕色脂肪的一部分，通过自身分解为游离脂肪酸为心脏供能，调节心脏温度，保护心脏自主神经起保护作用〔9,10〕。

Motoyama等〔11〕通过比较冠状动脉疾病(CAD)和非CAD(NCAD)患者的心外膜脂肪与腿部脂肪组织，证实了在CAD患者的心外膜脂肪中 NF-κB、TNF-α的表达明显升高 。Hung等〔12〕，心外膜脂肪中的炎性反应在很大程度上是通过脂多糖(LPS)与巨噬细胞表面的Toll样受体(TLR)-2或 4结合，利用NF-κB和JNK信号传导通路来参与AS过程。NF-κB 作为机体较为重要的一种核转录因子，其能够与κB位点的基因启动子特异性结合，加速基因启动子的转录表达，通过诱导其活化，来达到调控转录因子、炎症细胞因子、黏附因子的目的，参与炎性反应〔13〕。目前关于NF-κB 作为多种疾病治疗的分子靶点已引起学术界的广泛关注〔14,15〕。AS过程的产生也是炎症反应发生的过程，本研究结果表明，在泡沫模型细胞中 NF-κB炎症信号通路受到SIRT1的调控，SIRT1是 NF-κB信号的上游，推测，SIRT1可能通过脱乙酰化NF-κB来降低或阻止其促炎症反应信号的传导，来缓解AS斑块形成或促进其消退。既有文献〔15〕报道，在内皮细胞中SIRT1能够利用对NF-κB信号通路的关键步骤的干扰来实现抗炎症反应过程。动物试验也显示，敲除NF-κB的亚基P50可以明显缩小其斑块，且降低斑块内的泡沫细胞〔16〕。本研究结果提示机体通过调控NF-κB信号通路的活性，泡沫细胞中的炎症信号受到调节，进而影响AS斑块的形成及消退 。

参考文献4

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4Wang W，Feng SJ，Li H，etal.Correlation of lower concentrations of hydrogen sulfide with activation of protein kinase CβII in uremic accelerated atherosclerosis patients〔J〕.Chin Med J (Engl),2015;128(11)：1465-70.

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11Motoyama S，Ito H，Ozaki Y.Can lipid tissues including Epicardial Adipose Tissue (EAT)，Visceral Adipose Tissue (VAT) and coronary plaque be moving in the same direction〔J〕?Circ J,2015;79(5)：969-71.

12Hung WC，Tang WH，Wang CP，etal.Increased epicardial adipose tissue volume is associated with PR interval prolongation〔J〕.Clin Invest Med,2015;38(1)：E45-52.

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14Craig EA，Parker P，Austin AF，etal.Involvement of the MEKK1 signaling pathway in the regulation of epicardial cell behavior by hyaluronan〔J〕.Cell Signal,2010;22(6)：968-76.

15Sattler KJ，Galili O，Rodriguez-Porcel M，etal.Dietary reversal of experimental hypercholesterolemia improves endothelial dysfunction of epicardial arteries but not of small coronary vessels in pigs〔J〕.Atherosclerosis,2006;188(2)：301-8.

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〔2014-12-19修回〕

(编辑苑云杰)

基金项目：海南省应用技术研发与示范推广专项项目(No.ZDXM2015074)

中图分类号〔〕R446.1〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-6981-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.007