胰高血糖素样肽-1对肥胖2型糖尿病大鼠胰岛素敏感性的改善作用

王晋竹　葛　凤　娄　宁　胡晓琳　董振华　王文汇

(山东大学齐鲁医院(青岛)内分泌科,山东　青岛　266011)



胰高血糖素样肽-1对肥胖2型糖尿病大鼠胰岛素敏感性的改善作用

王晋竹葛凤娄宁1胡晓琳1董振华1王文汇

(山东大学齐鲁医院(青岛)内分泌科,山东青岛266011)

摘要〔〕目的探讨胰高血糖素样肽(GLP)-1对肥胖2型糖尿病(T2DM)大鼠胰岛素敏感性的改善作用及机制。方法12只6周龄雄性SD大鼠随机分为T2DM组、T2DM +GLP-1组及正常对照组(NC组)。T2DM组及T2DM +GLP-1组高脂喂养、NC组普食喂养4 w，给予T2DM组及T2DM +GLP-1组链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg腹腔注射建立T2DM模型。受试大鼠进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验。T2DM +GLP-1组大鼠在钳夹实验前30 min开始持续输注GLP-1，检测钳夹实验120 min葡萄糖输注率及0、30、60、90、120 min血清胰岛素浓度。Wester印迹法测定大鼠腓肠肌丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)磷酸化水平。结果与NC组比较，T2DM组钳夹实验120 min葡萄糖输注率降低(P<0.05),骨骼肌Akt磷酸化水平下降；与T2DM组比较，T2DM +GLP-1组钳夹实验120 min葡萄糖输注率增加(P<0.05)，骨骼肌Akt磷酸化水平升高；各组间胰岛素浓度变化无差异(P>0.05)。结论GLP-1可以增加平静状态T2DM大鼠葡萄糖摄取，改善骨骼肌的胰岛素敏感性，这一改善作用不依赖于胰岛素浓度的增加。

关键词〔〕胰高血糖素样肽-1；2型糖尿病大鼠；胰岛素敏感性；高胰岛素-正葡萄糖钳夹；骨骼肌

1山东大学附属济南市中心医院内分泌科

第一作者：王晋竹(1988-),女,在读硕士,主要从事糖尿病胰岛素抵抗的分子机制研究。

胰高血糖素样肽(GLP)-1作为肠促胰素家族的重要一员，主要通过刺激胰岛β细胞分泌胰岛素和抑制α细胞分泌胰高糖素发挥降糖作用，还能增加胰岛β细胞数量、延缓胃排空、抑制食欲、降低血脂、减轻体重、抗炎及保护心血管等，并且能影响机体的胰岛素敏感性。研究发现，给予胰岛素抵抗的肥胖Zucker(fa/fa)大鼠GLP-1类似物治疗6 w，可以产生胰岛β细胞团及胰岛素敏感性均增加的联合效应〔1〕。本课题组前期研究发现，持续输注GLP-1能增加急性胰岛素抵抗大鼠的骨骼肌微循环灌注及丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)磷酸化水平，提高骨骼肌对葡萄糖的摄取，增加骨骼肌胰岛素敏感性〔2〕。而对于伴有胰岛β细胞功能下降、胰岛素分泌减少的肥胖2型糖尿病(T2DM)大鼠胰岛素敏感性是否仍有改善作用，目前未见报道。本研究拟探讨GLP-1对T2DM大鼠胰岛素敏感性的改善作用及机制。

1材料和方法

1.1实验动物SPF级成年雄性SD大鼠12只，体重160～180 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2试剂与仪器GLP-1(7-36)amide(美国Baehem公司)；链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)；柠檬酸钠缓冲液(北京Solarbio公司)；50%葡萄糖(天津新郑股份有限公司)；普通速效胰岛素(礼来苏州制药有限公司)；拜耳血糖仪及配套拜安康试纸(德国Bayer公司)；胰岛素酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(北京优尼康生物科技有限公司)；抗Akt及其磷酸化抗体(美国Cell Signaling公司)；HRP标记山羊抗兔/鼠IgG(北京鼎国昌盛公司)；多功能凝胶成像化学发光仪(美国Cell Biosciences公司)；微量注射泵(保定申辰泵业有限公司)；动物血压监测仪(美国Harvard Apparatus)。

1.3动物模型构建12只6周龄SD大鼠随机分为T2DM组、T2DM+GLP-1组、正常对照组(NC组)，每组4只。T2DM组和T2DM+GLP-1组高脂饲料喂养4 w，过夜禁食不禁水12 h，称体重，STZ以30 mg/kg一次性腹腔内注射，继续给予高脂饮食。分别于第3、7天检测尾静脉血糖，当随机血糖≥16.8 mmol/L时，T2DM模型大鼠建造成功。

1.4动物手术大鼠隔夜禁食不禁水。称重，5%戊巴比妥钠1.2 mg/kg腹腔内注射。麻醉完全后仰卧位固定，沿颈部中线切开大鼠皮肤，依解剖层次钝性分离组织，行气管、左侧颈内动脉及双侧颈外静脉插管。左侧颈内动脉插管与连有动态血压监测仪的戊巴比妥钠微量注射泵连接；右侧颈静脉插管通过三通管分别连接葡萄糖及胰岛素的微量注射泵，T2DM+GLP-1组左侧颈静脉插管连接GLP-1微量注射泵。所有操作完成后将大鼠静置约30 min左右待麻醉状态稳定。

1.5高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验钳夹实验0 min时测定大鼠动脉血糖，同时以3 mIU·kg-1·min-1的速率持续输注胰岛素，实验2 min时以2 μl/min的速率持续输注30%葡萄糖，120 min时钳夹实验结束。期间每10 min测动脉血糖一次，根据血糖水平调整葡萄糖输注速率，维持血糖水平在基础值10%左右，于0、30、60、90、120 min采集动脉血，离心取上清，-20℃储存用于测定胰岛素水平。T2DM+GLP-1组大鼠于钳夹实验前30 min开始以30 pmol·kg-1·min-1速率持续输注GLP-1直至实验结束。实验过程中根据动态血压适当调整戊巴比妥钠输注量，以维持大鼠的麻醉状态稳定。

1.6血糖及胰岛素水平测定采用便携式血糖仪测定全血血糖，ELISA测定血清胰岛素水平。

1.7Western 印迹法测定AKt磷酸化水平用RIPA裂解液提取腓肠肌蛋白，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，转膜后封闭2 h，加一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加二抗室温2 h，TBST洗膜3次，ECL发光液滴膜，暗室显影拍照。

1.8统计学分析应用SPSS19.0统计软件处理。三组间数据比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验。

2结果

2.1各组大鼠葡萄糖输注率比较在120 min钳夹实验结束时，T2DM组葡萄糖输注率较NC组降低约54%(P<0.05)；T2DM+GLP-1组葡萄糖输注率较NC组降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与T2DM组相比，T2DM+GLP-1组葡萄糖输注率增加约51%(P<0.05)，见图1。

与NC组比较：1)P<0.05；与T2DM组比较：2)P<0.05图1　各组大鼠葡萄糖输注率比较

2.2各组大鼠血清胰岛素浓度比较T2DM+GLP-1组持续输注GLP-1后实验0 min与-30 min相比胰岛素浓度无差异(P>0.05)，各组间同一时间点胰岛素浓度差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2　各组大鼠血清胰岛素浓度比较

2.3各组大鼠平均动脉血压比较T2DM+GLP-1组钳夹实验-30 min、NC组与T2DM组钳夹实验0 min时无统计学差异(P>0.05)。持续输注GLP-1后，T2DM+GLP-1组血压在钳夹实验0 min时较-30 min下降约15%(P<0.01)，见图3。

与-30 min比较：1)P<0.05图3　各组大鼠平均动脉压比较

2.4腓肠肌Akt磷酸化表达T2DM组Akt磷酸化水平较NC组降低约53%，差异有统计学意义(P<0.01)，T2DM+GLP-1组Akt磷酸化水平较NC组差异无统计学意义(P>0.05)；持续输注GLP-1干预后，与T2DM组相比，T2DM+GLP-1组Akt磷酸化水平升高了约55%(P<0.01)，见图4。

与NC组比较：1)P<0.01；与T2DM组比较：2)P<0.01图4　腓肠肌的磷酸化Akt表达水平比较

3讨论

作为近年来治疗糖尿病的新一类药物，GLP-1的生理作用及其机制受到广泛关注。GLP-1主要通过葡萄糖浓度依赖性促胰岛素分泌及抑制胰高血糖素分泌发挥降糖作用，还能减弱胃肠道蠕动、延缓胃排空、降低食欲和食物摄入，减轻体重〔3〕。研究发现，给予胰腺部分切除的T2DM大鼠GLP-l受体激动剂Exentin-4能诱导胰岛β细胞的再生；采用GLP-1培养新鲜分离的人类胰岛可抑制β细胞的凋亡〔4,5〕，提示GLP-1有增加胰岛β细胞数量的作用。多项研究还发现，GLP-1可以通过增加心肌葡萄糖摄取增强心肌收缩力，改善左心室功能及血管内皮细胞功能紊乱〔6～8〕，从而达到保护心血管的作用。近年来在治疗肥胖T2DM患者时发现，GLP-1能升高血清Ⅲ型腺苷酸环化酶(AC3)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，降低甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的作用〔9〕。另外，GLP-1还能直接或间接影响免疫功能，产生抗炎作用〔10〕。GLP-1的这些生理作用与改善胰岛素抵抗建立了必然的联系。Parlevliet等〔11〕给胰岛素抵抗大鼠腹腔注射GLP-1受体激动剂4 w后发现，大鼠基础肝葡萄糖和极低密度脂蛋白(VLDL)的输出减少；同时通过高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验发现胰岛素敏感性增加。本课题组在前期研究发现GLP-1可以通过改善骨骼肌微循环灌注增加机体胰岛素敏感性〔2，12〕。本实验结果说明输注GLP-1对T2DM大鼠胰岛素敏感性也有明显的改善作用。

输注GLP-1并未产生对T2DM大鼠β细胞的刺激效应，GLP-1干预带来的大鼠葡萄糖输注率的增加，并非通过GLP-1刺激β细胞释放胰岛素的作用产生。GLP-1对β细胞的促胰岛素释放作用依赖于升高的葡萄糖浓度。由于受试大鼠实验过程呈空腹状态，钳夹实验时通过持续泵入高浓度胰岛素及不断调节葡萄糖输注率使血糖始终维持在基础水平，故未升高的血糖水平不足以使GLP-1产生刺激β细胞分泌胰岛素的作用，说明钳夹实验中GLP-1增加肥胖2型糖尿病大鼠的葡萄糖输注率，并非通过增加胰岛素分泌量这一途径实现的。

骨骼肌是葡萄糖最大的储存和利用器官，胰岛素调节的葡萄糖利用在骨骼肌占75%～95%。Vincent等〔13〕研究发现，在给予正常SD大鼠持续输注胰岛素30 min后骨骼肌微循环血流量增加，而一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)可抑制胰岛素诱导的早期骨骼肌微循环灌注及一氧化氮合酶(eNOS)的产生，还能抑制部分骨骼肌葡萄糖摄取率，说明骨骼肌的葡萄糖代谢与胰岛素介导微血管的开放有关。本课题组对正常大鼠的研究也发现，输注GLP-1能改善骨骼肌微循环灌注及胰岛素转运，有效增加骨骼肌Akt磷酸化水平，并伴有后肢骨骼肌葡萄糖摄取的明显增加〔2〕。本研究结果显示，GLP-1干预的T2DM大鼠骨骼肌Akt的磷酸化水平显著高于GLP-1未干预组。推测在T2DM大鼠，GLP-1也是通过改善骨骼肌微循环灌注，促进胰岛素通过内皮细胞PI3K-Akt-eNOS信号传导途径介导骨骼肌微血管开放进行跨内皮转运，进入骨骼肌间隙与肌细胞膜受体结合，增加骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取和利用〔14〕。

GLP-1对动脉血压的影响目前结果不完全一致。Barragan等〔15〕报告，GLP-1(7-36)酰胺通过非儿茶酚胺作用机制增加大鼠的平均动脉血压；Vilsb〔16〕则发现每天给予GLP-1类似物治疗的T2DM患者，动脉血压有所下降；Cabou等〔17〕进行3 h高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验，并同时持续注入大鼠侧脑室GLP-1受体激动剂，发现大鼠股动脉血压降低；Yu等〔18〕在给Dahl盐敏感型高血压大鼠注射GLP-1后，血管周围自主神经对乙酰胆碱的反应增加，诱导血管舒张增加。本课题组前期研究发现，通过对正常和胰岛素抵抗大鼠进行GLP-1干预后，骨骼肌微循环血流灌注量较基础值显著提高，但大鼠平均动脉血压无改变〔2〕。本研究发现GLP-1干预后平均动脉血压较未干预前下降，但这一降低作用并未影响钳夹实验中葡萄糖输注率的改善。考虑肥胖T2DM大鼠的肾素-血管紧张素系统(RAS)处于激活状态，血管内皮分泌的缩血管因子较舒血管因子增多，全身血管处于相对收缩状态。GLP-1可能是通过与其受体结合激活下游通路信使PKA，活化eNOS，增加NO释放〔19,20〕，从而纠正血管内皮细胞功能紊乱，起到舒张血管的作用。这一作用独立于GLP-1对骨骼肌微循环灌注的改善和胰岛素敏感性的增加。

参考文献4

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11Parlevliet ET,Schroder-van der Elst JP,Corssmit EP,etal.CNTO736,a novel glucagon-like peptide-1 receptor agonist,ameliorates insulin resistance and inhibits very low-density lipoprotein production in high-fat-fed mice〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2009;328(1):240-8.

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16Vilsb T.Liraglutide：a once-daily GLP-1 analogue for the treatment of type 2 diabetes mellitus〔J〕.Expert Opin Investig Drugs,2007;16(2):231-7.

17Cabou C,Campistron G,Marsollier N,etal.Brain glucagon-like peptide-1 regulates arterial blood flow,heart rate,and insulin sensitivity〔J〕.Diabetes,2008;57(10):2577-87.

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〔2015-01-08修回〕

(编辑李相军)

Effects of glucagon-like peptide-1 improving insulin sensitivity in obese type 2 diabetic rats

WANG Jin-Zhu,GE Feng,LOU Ning,etal.

Department of Endocrinology,Qilu Hospital,Shandong University,Qingdao 266011,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of Glucagon-like peptide(GLP)-1acted with insulin sensitivity in obese type 2 diabetic(T2DM)rats.MethodsTwelve SD rats were randomized into T2DM,T2DM+GLP-1 and normal control(NC)groups.Rats of T2DM and T2DM+GLP-1 groups were fed with high fat diet for four weeks.The glucose infusion rate at 120 min and insulin concentration at 0,30,60,90,120 min were measured by Hyperinsulinemic-euglycemic clamps.The gastrocnemius serine/threonine protein kinase(Akt)phosphorylation was measured by Western blot.ResultsCompared with that of NC group,the glucose infusion rate at 120 min of T2DM group was lower〔(3.03±1.39)vs(6.52±1.73)mg·kg-1min-1,P<0.05〕,the skeletal muscle Akt phosphorylation levels of T2DM group was decreased.Compared with that of T2DM group,the glucose infusion rate at 120 min of T2DM+GLP-1 group was raised〔(6.09±1.75)vs(3.03±1.39)mg·kg-1min-1,P<0.05〕,so do the Akt phosphorylation levels of skeletal muscle in T2DM+GLP-1 group.There was no difference of insulin concentration among three groups.ConclusionsGLP-1 increases glucose uptake and improves insulin sensitivity of skeletal muscle in tranquility status of T2DM rats.This action of GLP-1 is not with an increase of blood insulin concentration.

【Key words】Glucagon-like peptide-1;Type 2 diabetic rats;Insulin sensitivity;Hyperinsulinemic-euglycemic clamps;Skeletal muscle

通讯作者：王文汇(1963-),女,教授,博士生导师,主要从事糖尿病胰岛素抵抗的分子机制研究。

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81070632)；中华医学会糖尿病临床医学科研专项资金(12030490349)

中图分类号〔〕R587.1〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-6984-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.008