去卵巢和性成熟期ICR雌性小鼠动情周期的观察*

杜纳纳，　许丹丹，　黄莉莉

(黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)



去卵巢和性成熟期ICR雌性小鼠动情周期的观察*

杜纳纳，许丹丹，黄莉莉△

(黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

[摘要]目的： 观察处于性成熟期和去卵巢ICR小鼠的动情周期特点。方法: ICR雌性小鼠分为正常对照组、假手术组和去卵巢组，术后第8天开始，连续12 d，每日9:00和16:00分别做2次阴道涂片，记录并观察各组小鼠外阴和阴道涂片细胞特征，规律动情周期发生率，动情周期天数和动情周期各期持续时间。结果: 正常对照组与假手术组动情周期特点表现相似，85%处于性成熟期的ICR小鼠呈规律动情周期，多数为6 d周期(83%)，少数为5 d动情周期(17%)；与5 d相比，6 d的动情期持续时间明显增加(P<0.05)。5 d和6 d动情周期阴道涂片细胞特征在数量和种类略有所不同。去卵巢组小鼠约76%呈动情周期紊乱，表现为连续动情间期。结论: ICR雌性小鼠具有自身品系的动情周期特点。

[关键词]ICR小鼠； 去卵巢； 动情周期； 阴道涂片

ICR雌性小鼠是医学实验中常用的实验动物，处于性成熟期的雌性小鼠表现出生殖器官增生、退化的周期性变化，即动情周期。动情周期紊乱是反应性激素失调的敏感指标，故去卵巢小鼠可作为围绝经期动物模型。有关雌性小鼠动情周期特点尚缺乏系统性论述，而且我们在实验中亦观察到，在阴道涂片细胞特征以及动情周期天数方面，可能是基于动物品系和实验操作方法等原因，实验结果不尽一致。为此，本研究通过连续12 d对处于性成熟期和去卵巢ICR小鼠进行阴道组织涂片观察，确定动情周期内各期的外阴特征、持续时间和阴道涂片细胞特征，以及处于规律和无规律动情期小鼠的发生例数，以探讨ICR雌性小鼠动情周期特点，为从事相关实验研究提供数据参考。

材料和方法

1实验材料

1.1动物ICR小鼠，雌性，7～8周龄，体重23～25 g，SPF级，由黑龙江中医药大学提供，动物许可证号为SCXK(黑)2013-004。

1.2实验环境温度(18～22 ℃)，湿度(70%～85%)，12 h明暗交替(光照7:00～19:00，黑暗19:00～7:00)。

1.3实验仪器B-2 型光学显微镜由上海齐跃生物科技有限公司生产； 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9055为上海岛韩实业有限公司产品。

1.4实验试剂亚甲基蓝25 g(天津市致远化学试剂有限公司)，氢氧化钾500 g(天津市瑞金特化学品有限公司)，生理盐水 ，95%乙醇，蒸馏水。

2方法

2.1分组及手术96只ICR小鼠，随机分成3组，分别为正常对照组(24只)、假手术组(24只)和去卵巢组(48只)。去卵巢组依照文献方法[1]摘除双侧卵巢，缝合皮肤，术后恢复7 d；假手术组，仅摘除双侧卵巢旁同样大小的脂肪团，术后恢复7 d。正常对照组未经任何处理。

2.2美兰染色液的配制称取亚甲基蓝0.6 g和氢氧化钾0.01 g，溶于95%乙醇30 mL中，再加蒸馏水100 mL，搅拌均匀，备用。

2.3阴道涂片各组ICR小鼠术后第8天开始，于每日9:00和16:00分别做2次阴道涂片，连续 12天。每次涂片前，固定ICR小鼠并翻提尾巴露出阴门，记录观察其阴门开张、阴门黏膜颜色及外阴肿胀情况。

阴道涂片操作如下：左手按常规捉拿固定ICR小鼠，右手取一钝头吸管，吸入生理盐水0.2 mL，轻轻插入阴道2～3 mm，反复抽吸2～3次，取出吸管，将滴管内洗液滴于玻片上，铺平，干燥，将干燥的载玻片置于美兰染色液中，染色10 min，用蒸馏水从涂片边缘慢慢冲洗剩余的美兰溶液，切勿把细胞冲掉，并使之干燥，干燥后，在显微镜下观察阴道涂片的细胞学变化[2]。

2.4数据处理规律动情周期的界定：动情周期内各期变化的顺序依次为动情前期，动情期，动情后期和动情间期，并呈周期性变化。动情周期内各期持续时间的界定：以各期阴道涂片时间作为该期的起始时间，该期转换为下期时的阴道涂片时间作为结束时间，间隔时间为持续时间。

3统计学处理

本实验数据统计分析使用SPSS 17.0统计软件完成。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，计量资料采用组间t检验，计数资料采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1正常对照组和假手术组ICR小鼠呈规律动情周期变化的发生情况

与正常对照组相比，假手术组中ICR小鼠呈规律动情周期变化的发生例数无明显差异。正常对照组和假手术组中平均约85%的ICR小鼠表现出规律的动情周期变化，见表1。

表1正常对照组和假手术组呈规律动情周期变化ICR小鼠的发生率

Table 1.Occurrence rate of regular estrous cycle of female ICR mice between normal group and sham operation group (n=24)

GroupThenumberofregularestrouscycleOccurrencerate(%)Normal2187.5Shamoperation2083.3

2正常对照组和假手术组ICR小鼠动情周期的外阴特征

通过对阴道涂片前ICR小鼠外阴情况观察与阴道涂片确定的动情周期比对，正常对照组和假手术组动情周期各期外阴特征表现相似。动情前期，阴道口一般为微开张或闭合，阴门口呈粉色，阴门微皱襞、轻微红肿。动情期，阴道口半开或全开张，阴门口呈红色，皱襞明显肿胀。动情后期，阴道口半开，阴门口呈苍白色，阴门皱襞轻微肿胀。动情间期，阴道口紧闭，阴门口呈苍白色，阴门皱襞无肿胀。由上述可见，动情周期内各期外阴特征区分不甚明显，仅通过外阴特征难以判定动情周期各期。

3正常对照组和假手术组ICR小鼠规律动情周期内各期的持续时间

与正常对照组相比，假手术组ICR小鼠动情周期为5 d或6 d的发生率无显著差异。ICR小鼠动情周期为5 d或6 d内各期的持续时间两组亦无显著差异(P>0.05)。结果显示，ICR小鼠的动情周期一般为5～6 d，且多数为6 d，比例达84%(P<0.05)，见表2。

表2正常对照组和假手术组ICR小鼠规律动情周期内各期的持续时间以及5 d和6 d动情周期的比例

Table 2.Each stage duration of regular estrous cycle and the occurrence rate of 5 d and 6 d cycles in female ICR mice between normal group and sham operation group (Mean±SD.n=24)

GroupEstrouscycle(d)Occur-rencerate(%)EachstageofestrouscycleTimeofduration(h)Normal519Preoestrus10.45±2.31 Oestrus38.23±6.57 Metoestrus14.86±1.34 Diestrus54.28±15.34 681Preoestrus12.00±1.58 Oestrus52.60±5.37* Metoestrus18.40±6.07 Diestrus58.40±13.10Sham516Preoestrus11.67±1.53opera-tion Oestrus41.30±4.72 Metoestrus12.67±0.57 Diestrus52.67±6.43 684Preoestrus11.56±2.89 Oestrus55.19±8.59* Metoestrus15.31±5.35 Diestrus56.06±12.97

*P<0.05vs5 d.

4动情周期各期阴道涂片的细胞变化情况

5 d组和6 d组动情周期各期在细胞数量和种类方面都有所不同。动情前期和动情后期，5 d组和6 d组阴道涂片细胞表现相近。动情期，除了出现大量的角化细胞这种细胞类型外，与5 d组3种细胞共存相比，6 d组表现为2种细胞共存。动情间期，白细胞和有核上皮细胞共存，还可见少量角化细胞，见图1、表3。

5去卵巢组ICR小鼠的外阴特征及涂片细胞特点

去卵巢组ICR小鼠阴道口大部分呈现阴道口紧闭、阴门口呈白色，皱襞无肿胀，也有个别小鼠出现阴门呈浅红色，皱襞轻微红肿现象，阴道涂片确定均为动情间期。ICR小鼠，手术去卵巢后，76%去卵巢小鼠呈无规律动情周期，表现为连续动情间期。与正常对照组或假手术组相比，动情间期涂片细胞主要为白细胞，且分布密集，少见有核上皮细胞。

讨论

本实验对ICR雌性小鼠动情周期特点进行了系统研究。实验结果显示，与正常对照组相比，假手术组术后恢复1周，手术应激对小鼠动情周期的天数、呈规律动情周期的动物发生率及动情周期内各期的持续时间均无明显影响。因此，有关动情周期的实验设计中，可仅设立假手术组，而无须设立正常对照组，以避免实验动物浪费。

Figure 1.The vaginal smear photograph of each stage of estrous cycle in mice (methylene blue staining, ×200).a: cornified epithelial cells； a*: dense cornified epithe-lial cells; b: nucleated epithelial cells； b*: dense nucleated epithelial cells; c: leucocytes； c*: dense leucocytes; (a): small cornified epithelial cells; (b): small nucleated epithelial cells; (c): small leucocytes.

图1小鼠动情周期各阶段阴道涂片

表3不同动情周期阴道涂片细胞变化情况

Table 3.The feature of vaginal smear cytology in each estrous cycle stage (n=24)

EstrouscyclePreoestrusOestrusMetoestrusDiestrus5dab*(c)a*/a*(bc)a*c(b)/abcc*b(a)6dab*(c)/aba*/a*(b)/a*(c)a*c(b)c*b(a)/c*(ab)

a: cornified epithelial cells； a*: dense cornified epithelial cells; b: nucleated epithelial cells； b*: dense nucleated epithelial cells; c:leucocytes； c*: dense leucocytes; (a): small cornified epithelial cells; (b): small nucleated epithelial cells; (c): small leucocytes.

阴道涂片法是判定小鼠动情周期的常用方法之一[3]，在实验动物例数较多的情况下，尽管其操作相对简单，但是仍会大幅度的增加实验工作量。阴道涂片主要是从主观上判断，缺乏完全客观标准，较适宜于动态观察，另遇阴道感染时，亦可见大量白细胞，难以与动情间期的白细胞为主的情况相区别，出现假阴性现象。本实验结果显示，7～8周龄(体重23～25 g)ICR雌性小鼠约85%表现出规律的动情周期变化，ICR小鼠手术去卵巢后，约有76%去卵巢小鼠动情周期紊乱，表现为连续动情间期。为此，我们认为，如仅为筛选是否处于规律动情周期或动情周期紊乱，而不以考察动情周期动态变化为目的，可以考虑免去阴道涂片步骤。以往绝大多数文献在方法学中论述，去卵巢小鼠出现动情周期紊乱，但具体表现未说明[4]。本实验结果亦观察到，去卵巢小鼠多数呈动情周期紊乱，主要表现为连续动情间期，涂片细胞主要为白细胞，无角化细胞，少见有核上皮细胞，与文献报道一致[1,5]。

通过对阴道涂片前小鼠外阴情况观察与阴道涂片确定的动情周期比对，小鼠动情周期各期，尤其是动情前期，动情间期和动情后期的外阴特征情况难以用肉眼区别，相比较之下，动情期可见明显外阴特征，即阴门口颜色较红，皱襞明显肿胀。有文献报道，通过外阴情况判断动情周期中动情期，与阴道涂片相比较，有42%相之符合[3]。本实验结果亦表明，仅通过外阴特征难以判定动情周期各期，需要结合阴道细胞涂片的方法来确定。

已有文献报道，动情周期的长短及持续时间受到遗传、饲养条件、应激等因素的影响[6-7]。因此有必要对不同品系的动情周期特点进行研究，以作为实验参考。本实验结果显示，ICR小鼠动情周期多为6 d，也有的为5 d。与动情周期5 d的动情期持续时间相比，动情周期6 d的动情期持续时间明显增加，可见ICR小鼠动情周期的长短主要取决于动情期的长短。另本实验结果得出，动情前期持续时间相对较短，如果每天仅1次阴道涂片观察，会错失动情前期。

阴道涂片细胞通常分别为角化上皮、有核上皮细胞和白细胞，3种细胞形态较易区别[8]。本实验结果显示，动情前期，常见角化细胞和有核上皮细胞共存；动情期，可见大量角化细胞，亦可见少量有核上皮细胞或少量白细胞；动情后期，3种细胞共存，白细胞数量增多；动情间期，白细胞和有核上皮细胞共存，偶见少量角化细胞。动情周期各期细胞并存居多，这主要是因为小鼠动情周期的每个阶段是连续的、逐渐变化的动态过程，所以阴道脱落的细胞也是逐渐转变的，在动情周期各期转变过程中，常常会出现过渡型细胞表现。在实验过程中，我们亦观察到，通过阴道涂片评判动情周期各期时，还需结合上次的阴道涂片结果，综合进行分期判定。

综上所述，ICR雌性小鼠具有其品系的自身的动情周期特点，动情周期多数为6 d，动情期的长短决定了动情周期的天数。去卵巢小鼠表现为动情周期紊乱，且发生率较高，可作为围绝经期动物模型。然而，有关ICR小鼠动情周期内性激素水平的变化，还有待进一步研究。

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[3]何秋明，肖尚杰，夏慧敏. 大鼠阴道涂片的观察[J]. 广州医学院学报, 2007, 35(4):54-56.

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[5]徐静婷，曹亚麟，郑文晖，等. 加减一阴煎改善去势大鼠内皮功能紊乱[J]. 中国病理生理杂志, 2015, 31(6):1008-1013.

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[8]张森，王新，韦旭斌，等. 大鼠发情周期各阶段的阴道细胞变化观察[J]. 动物医学进展, 2006, 27(2):69-72.

(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Observation of estrous cycle in sexual maturation and ovariectomized female ICR miceDU Na-na, XU Dan-dan, HUANG Li-li

(PharmaceuticalCollege,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China.E-mail: 908668195@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the characteristics of estrous cycle of female ICR mice and ovariectomized mice that had reached sexual maturity stage. METHODS: ICR mice were randomly divided into 3 groups, normal group, sham operation group and ovariectomized group. After ovariectomy and sham operating, at the 8th day, the mice were taken vaginal smears twice daily (09:00 and 16:00) for 12 consecutive days. The feature of vulva in the mice and vaginal smear cytology, occurrence rate of regular estrous cycle, duration of estrous cycle and each stage duration of estrous cycle were recorded and observed. RESULTS: The characteristics of estrous cycle in normal group and sham operation group were similar. Nearly 85% of the ICR mice in sexual maturity stage showed regular estrous cycle. The majority manifested 6-day cycle (83%), and only a small number exhibited 5-day cycle (17%). Compared with 5-day group, the duration of oestrus was significantly increased in 6-day group (P<0.05). The number and kind of the cells in vaginal smear were a little different between 5-day and 6-day groups. The ovariectomized mice which showed irregular estrous cycle (76%) were characterized by continuous diestrus. CONCLUSION: Female ICR mice have the strain characteristics of estrus cycle.

[KEY WORDS]ICR mice; Ovariectomy; Estrous cycle; Vaginal smear

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.033

[中图分类号]R329.21

[文献标志码]A