基于代谢组学的中医证型物质基础研究进展

白 晗任献青

1.河南中医药大学，河南郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院，河南郑州 450000

基于代谢组学的中医证型物质基础研究进展

白 晗1任献青2▲

1.河南中医药大学，河南郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院，河南郑州 450000

中医证型是中国传统医学辨证论治的产物，关于中医证型的标准化研究是中医现代化的标志，相关的物质基础研究是其重要组成部分。代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后逐渐兴起的学科。以“航拍角度”探测生物体在不同生理病理条件下的下游代谢物质，可准确反映出生物体实时代谢状态，与中医的整体性、动态性、即时性更为贴近。基于代谢组学的中医证型标准化研究拥有广阔的发展前景。

代谢组学；中医证型；物质基础；代谢标志物

中医证型标准化研究是中医现代化的必由之路，包括证型分类标准化和物质基础研究两大部分。继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后，代谢组学的兴起为中医证型物质基础研究提供了新的契机，本文就基于代谢组学的中医证型物质基础研究进行阐述。

1 中医证型标准化研究

中医“证”是对疾病过程中所处一定阶段的病位、病因、病性以及病势等所作的病理性概括，是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种整体功能状态，并随着病程的发展而发生相应变化[1]。近年来，研究学者多运用流行病学、循证医学、数理统计学方法进行中医证型标准化研究，取得了丰富成果。中医证型物质基础领域的研究方兴未艾，对于专业技术手段要求较高。基因组学、转录组学、蛋白质组学都曾被用于此，但研究方法多以某一种或几种分子或蛋白质为研究对象，所得结果较为局限、单一，无法突出中医证型的整体性、动态性等特点。

代谢组学时代，发现微观物质的联系相当广泛，某一物质的改变会导致全盘的变动，这符合现代系统论原理，即任何一种生命现象都是整体层面的复杂生理活动的有机整合[2]。代谢组学技术以机体某一中医证型状态为横断面，全面检测该状态下机体代谢下游的小分子化合物，可为中医证型提供明确的物质基础。

2 代谢组学

2.1 概况

1971年，Devaux等[3]提出代谢轮廓分析技术，但并未广泛使用；1983年，Nicholson等[4]最早把1H NMR技术用于检验血浆、血清中的小分子代谢物；1999年，Nicholson等[5]概括代谢组学定义为，以动物的体液或组织为研究对象，研究生物体对生理病理刺激或基因修饰产生的代谢物质的质和量的动态变化；2000年，Fiehn等[6]正式提出“代谢组学（metabolomics）”这个名词。

代谢组学是对代谢路径最终代谢产物进行分析研究，因其能准确地反映出机体整体的代谢水平状况，故可更直观、更客观地反映出生命活动的本质的过程[7]。因此代谢组学技术也更符合以整体观念和辨证论治为特色的中医学的要求，是中医学融入现代系统生物学的重要途径。

2.2 研究方法

代谢组学主要技术手段是核磁共振（NMR），液-质联用（LC-MS），气-质联用（GC-MS），色谱（HPLC，GC）等。通过单独或联合应用这些技术手段，研究者能够对生物体代谢过程中的各种化合物进行全面和定量分析[8]。通过检测一系列样品的谱图，再结合化学模式识别方法，可以判断出生物体的病理生理状态，基因的功能，药物的毒性和药效等，并有可能找出与之相关的生物标志物（biomarker）[9-10]。

2.3 生物样本采集

因尿液、血清或血浆包含上百种待测物质，获取途径也较方便，已成为目前代谢组学研究中最常用的样本[11]，其他如脑脊液、胆汁、消化液、唾液、精液、羊水等，亦可作为代谢组学研究的样本。血液样本反映机体对病理或生理刺激的瞬时信息，评价机体的动态平衡。尿液标本常包含一段时间内产生的代谢信息，反映机体当前的生理或病理状态、生物学年龄，也可预测各种先天不足或外环境影响的致病率[12]。

2.4 测定方法

代谢组学技术包括核磁共振（NMR）、气相色谱法（GC）、液相色谱法（LC） 、高效液相色谱法（HPLC） 和质谱法（MS）[13]等单分析技术及液相色谱-质谱联用（LC-MS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）[14]等多分析技术，其中以色谱-质谱联用、NMR 技术最为常用。

2.5 数据分析

基于代谢组学的数据分析方法有主成分分析法（PCA）、偏最小二乘法-判定分析（PLS-DA）、人工神经元网络（ANN）、聚类分析（NLM）等模式识别技术[15]，其中以PCA和PLS-DA最为常用。PCA是常用的非监督性模式识别方法，可实现数据降维的目的，利于了解数据整体情况；PLS-DA 是基于偏最小二乘法（PLS）线性回归的统计分析方法，属于有监督模式识别方法，常适用于样本量少、变量多、变量之间有相关性以及存在噪音变量干扰等情况。相对于 PCA 所得到的得分图，PLS-DA 可以获得更好的分类效果[16]。

3 代谢组学在中医证型物质基础研究中的应用

3.1 心血瘀阻证

简维雄等[17]采用GC-MS对冠心病（CHD）心血瘀阻证和非心血瘀阻证患者的血浆进行检测，并进行多元统计数据分析，发现花生四烯酸、乳酸、硬脂酸、尿素等9种代谢物为CHD心血瘀阻证患者的血浆代谢产物谱。其课题组之后进行了对应的动物造模方法研究[18]，采用结扎大鼠冠状动脉左前降支复制急性心肌梗死（ AMI） 心血瘀阻证模型，运用 GC-MS 检测方法，并对代谢产物进行主成分分析、偏最小二乘法分析，发现大鼠 AMI 心血瘀阻证与心肌组织代谢产物苹果酸、谷氨酸、甘氨酸、葡萄糖、延胡索酸等含量的改变密切相关。课题组[19]又使用KEGG数据库对相关代谢物代谢通路进行检索和构建，并对代谢产物分子注释、相关的酶或转运蛋白行检索，进行代谢产物路径分析，发现冠心病心血瘀阻证患者中“半乳糖代谢”“酮体的合成和降解通路”发生变化参与其病理过程。

3.2 热伤肾络证

耿雨作[20]选择符合条件的紫癜性肾炎热伤肾络证、非热伤肾络证患儿各9例，健康患儿22例，运用代谢组学技术，以尿液为研究对象，初步得出儿童紫癜性肾炎热伤肾络证的特异性代谢产物可能是丙酸、醛固酮、均聚L-精氨酸、维生素K2、钝叶素葡萄糖苷、S-氨甲基二氢硫、苯丙精氨酸、L-蛋氨酸、同型半胱氨酸硫内酯、羟基络醇4-硫酸醋、精氨酰丝氨酸、雌酮、色氨酰蛋氨酸。

3.3 肺气虚证

刘志刚等[21]将56只大鼠随机分为对照组和模型组，模型组建造肺气虚型COPD大鼠模型，并与对照组相比较，采用HPLC-MS/MS检测方法检测血浆代谢物，对数据进行多元统计分析后发现精胺、双氢神经酰胺、十二烷二酰肉碱等10种代谢物为COPD肺气虚证可能的疾病标记物。

3.4 气虚血瘀证

朱明丹等[22]选择当地医院符合心肌梗死恢复期气虚血瘀证纳入标准的患者为研究对象，年龄40～70岁， 共30例，空腹采集静脉血标本，离心后取上清液，进行代谢组学特征谱的研究，发现心肌梗死恢复期气虚血瘀证较健康对照组溶血磷脂酰胆碱，亚油酸、花生四烯酸、鞘氨醇类物质的代谢水平均下调。

3.5 脾气虚证与脾阳虚证

王颖等[23]以多因素复合的方法建立脾气虚、脾阳虚大鼠模型，以1H NMR技术对大鼠进行血浆代谢组学检测，分别采用弛豫编辑（CPMG）和扩散编辑（LED）脉冲序列对代谢物进行观察，发现脾气虚证的可能代谢物有：葡萄糖、乳酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脂类等12种；脾阳虚证可能代谢物有：葡萄糖、乳酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺等13种，该二证型主要存在能量代谢、脂代谢和糖代谢等异常。

3.6 先天伏寒证

魏岩等[16]发现利用代谢组学方法能够确定冠心病心绞痛患者先天伏寒证与非先天伏寒证间存在着明显的差异性代谢产物，高密度脂蛋白、丙氨酸、乳酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、脂类化合物有可能成为冠心病先天伏寒证的潜在生物标记物。

3.7 痰浊证与血瘀证

张红栓等[24]选择符合纳入标准的冠心病心绞痛痰浊痹阻证（痰浊证）， 心血瘀阻证（血瘀证）患者各10例，对其血浆样本进行H NMR检测，用主成分分析与偏最小二乘判别分析处理图谱数据，发现痰浊证组乳酸、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白等12种代谢物含量高于血瘀证组；反之，血瘀证组丙氨酸、高密度脂蛋白、不饱和脂肪酸等7种代谢物含量高于痰浊证组。

3.8 痰浊证与气虚证

程鹏等[25]选取冠心病患者65例（痰凝心脉证37 例，心气虚弱证28 例），应用GC /MS技术测定两种证型患者的血清内源性代谢物，并分析其代谢谱之间的差异，最终得到准确定性的化合物 46 个，对鉴别这两种证型贡献值最大的化合物为丝氨酸，其次为缬氨酸、2-羟基丙酸等。对两种证型代谢物量进行比较，发现痰浊证丝氨酸、2-羟基丙酸显著高于气虚证组（P＜0.05）。

3.9 脾气虚证与脾胃湿热证

施旭光等[26]选择慢性浅表性胃炎脾气虚证、脾胃湿热证患者各10例，健康志愿者10例 ，对其尿液进行H-NMR检测，并采用多元统计数据分析，在脾气虚证患者和健康志愿者尿液中共筛选得到谷氨酸、甲硫氨酸、α-酮戊二酸、二甲基甘氨酸、肌酐、牛磺酸及葡萄糖7种差异代谢产物；在脾胃湿热证患者和健康志愿者尿液中筛选得到2-羟基丁酸、氧化三甲胺、牛磺酸、马尿酸4种差异代谢产物；在脾气虚证和脾胃湿热证患者中筛选得到岩藻糖、β-羟基丁酸等11种差异代谢产物。

4 问题与展望

（1）代谢组学技术应用于中医证型研究尚未成熟，关于代谢组学的试验操作标准、液相、气相及质谱条件标准和数据分析等，仍有待确立相应的技术标准[27]；（2）国内目前基于代谢组学的中医证型研究多以动物造模为研究对象，缺乏临床病例的大样本量研究。由于中医证候的多样性、复杂性和易变性，动物模型无法完全模拟人体代谢状态，也不可忽略动物模型与人体存在的差别[28]。（3）中医证型分类以临床表现为基础，可见主证和标证，不同症候间相互兼夹，对其物质基础分析会有一定影响，这也导致了研究结果的重复性较低[29]； 但相较于基因组学、蛋白质组学和转录组学等技术，代谢组学有其不可忽略的优势，其整体性、动态性的研究方法，与中医证型有异曲同工之妙，已成为现今中医证型物质基础研究不可替代的技术手段。

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Research progress on material basis of TCM Syndrome based on metabonomics

BAI Han1REN Xianqing2
1.Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China; 2.The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

TCM Syndrome Types is the product of traditional Chinese medicine syndrome differentiation and treatment. Research on standardization of TCM syndrome type is the symbol of modernization of traditional Chinese Medicine. The research of related material basis is an important part. Metabonomics is a subject that has been developed gradually after genomics, proteomics and proteomics. investigation of the downstream metabolites of organisms under different physiological and pathological conditions under “Aerial view” accurately reflect the metabolism of organisms in real time. It is more closer to the integrity, dynamics, immediacy of Chinese medicine. Study on standardization of TCM Syndrome Types based on metabonomics has broad prospects for development.

Metabonomics; TCM Syndrome; Material basis; Metabolic marker

R223

A

2095-0616（2016）21-52-04

2016-09-08）

▲通讯作者