干细胞治疗脑出血后神经功能损伤的临床研究进展

郭现利张俊义王建军王少勃张立欣

1.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学附属鄂尔多斯市中心医院，内蒙古鄂尔多斯 017000

干细胞治疗脑出血后神经功能损伤的临床研究进展

郭现利1，2张俊义2▲王建军2王少勃2张立欣2

1.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学附属鄂尔多斯市中心医院，内蒙古鄂尔多斯 017000

脑出血常常造成神经细胞的坏死与凋亡，严重影响患者预后功能。对于脑出血的临床治疗常常为保守或手术清除血肿。然而对于神经细胞的损失临床治疗常常不能很好的解决。干细胞，特别是神经干细胞具有自我更新和多向分化潜能。其为神经损失修复带来了希望。本文从脑出血后内源性及外源性神经干细胞移植治疗的临床效果及潜在机制进行综述，为研究脑出血提供参考。

干细胞；脑出血；修复；移植

随着建筑及公共交通的不断发展，颅脑创伤的发病率呈上升趋势。我国是发展中国家，颅脑创伤的形势也十分严峻。随着临床及基础研究的不断深入，人们对颅脑创伤的机制及治疗有了长足的进展。临床药物不断更新，手术方式不断改进，在治疗重度颅脑创伤方面也取得了一定的成绩。但此类患者后续的功能恢复常常存在一些问题和不足。干细胞是近年来研究较多的细胞之一，他被认为具有多向分化潜能，能够修复多种组织损伤。干细胞用于动物及人体颅脑创伤的修复也有很多报道，本文就干细胞治疗脑出血后神经功能损伤的临床研究做一综述，为今后的干细胞治疗颅脑创伤提供临床参考。

1 脑出血治疗现状

在我国脑出血占全部脑卒中的20%～30%，急性期病死率为30%～40%，幸存患者中大部分有轻度到重度的残疾，极大的降低了患者的生活质量，同时也给家庭和社会带来沉重负担[1]。脑出血是脑部自发性的、非外伤性的出血进入脑实质内，形成血肿，诱发脑水肿和局部炎症，使神经元和神经胶质细胞受到严重的伤害，导致脑细胞凋亡，所以脑出血后语言及肢体活动能力、认知学习记忆能力受到极大影响，功能恢复异常困难。临床治疗脑出血，传统方法多为改善脑部血液循环、营养脑神经、康复锻炼以及手术清除血肿等对症治疗，效果均不甚理想。现在研究发现，干细胞治疗脑出血取得了一定的效果[2]。干细胞具有自我更新能力，它同时还能够分化为多种细胞类型，其增殖速度也比成体细胞快，在一定环境刺激下，能够做出反应。多种来源的干细胞移植治疗脑出血均是安全的，且均可改善脑出血带来的各种神经功能损害[3]。

2 干细胞种类及作用

2.1 干细胞种类

干细胞治疗脑出血主要分为两个方面：（1）内源性干细胞；（2）外源性干细胞。

内源性干细胞治疗作用：研究证实，在多种动物的侧脑室壁，海马齿状回和室管膜下区均能否分离培养出神经干细胞（NSCs）。以往人们普遍的认识是中枢神经系统缺乏再生和修复的能力。然而近年来的研究表明：内源性NSCs可在脑组织受到一定程度损失时被激活，激活的NSCs具有增殖潜能强，迁移距离远，可向神经细胞分化[4]，所以脑出血后神经功能可部分恢复，不过受损的神经元数量较多时，被激活的NSCs可能无法补充受损神经元的丢失。最终神经功能不能很好的修复。因此临床常常需要外源性扩增的干细胞进行系统治疗。

外源性干细胞的治疗作用：目前临床常用的外源性干细胞包括：骨髓源性间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）、神经干细胞（neural stem cells，NSCs）、脐源性间充质干细胞、脐带间充质干细胞和胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）等。

2.2 干细胞作用

神经干细胞：NSCs是一类具有强大自我更新、增殖及分裂潜能的干细胞。NSCs可通过不对称细胞分裂方式，产生神经元、胶质细胞及神经元前体细胞，进而组成功能性脑组织。NSCs可在多种组织中分离培养获得，例如哺乳动物神经组织及早期胚胎等。NSCs在体内外局部微环境调节下，可直接分化为神经细胞和胶质细胞，通过分泌神经营养因子调节细胞功能，减少恢复时间和提高功能恢复[4]；同时还与损伤周围区域的细胞具有同源性，具有较大的临床治疗价值。理论上NSCs被认为是脑出血治疗最为理想的种子细胞。然而NSCs较难获得、获取的量较少及伦理问题，其在临床实验及应用上受到了一定限制。

骨髓间充质干细胞：BMSCs研究较多也较早，它也具有良好的多向分化潜能。在一定条件的刺激下BMSCs可以分化为神经细胞。与NSCs不同的是，BMSCs来源较为丰富，体外培养扩增快，并且具有自体移植，无免疫排斥反应等优点，移植后与宿主大脑整合并长期存活，能够转染和表达外源性基因，能够通过血脑屏障，并促进小胶质细胞形成等特性。朱建新等[5]将脑出血患者血肿清除后，将自体BMSCs注入血肿腔的周围，对移植后的神经功能进行连续的评价，患者的神经功能和活动能力均显著改善。Tian等[6]发现自体骨髓间充质干细胞移植能改善患者神经功能缺损程度并提高日常生活活动能力。王万宏等[7]证实，自体骨髓间充质干细胞可降低脑出血患者血清中的GFAP、S100β水平，改善脑出血患者神经组织损伤修复。

脐源性干细胞：脐源性MSCs是在脐带及脐带血中分离培养而来，有持续增殖及多向分化的潜能。有报道称脐带源性MSCs富含造血、间充质、神经及内皮等多种干/组细胞，更倾向于向内胚层及神经系统方向分化[8]，且细胞原始移植后很少发生抗宿主反应、增殖和多向分化能力强、收集过程相对简单无创、病毒感染概率小、不受年龄的限制、无道德伦理问题、易于工业化制备等优点，使脐源性干细胞成为细胞治疗最理想的种子来源。袁进国等[9]发现，来源于脐带中的间充质干细胞体外培养后移植治疗脑出血后遗症，无特殊不良反应，配合综合康复治疗患者各项功能均表现出良好的临床恢复效果。李秀云等[10]将人脐血分离培养的MSCs注入到26例的脑出血患者的蛛网膜下腔中，经过半年的随访发现，23例脑出血患者干细胞治疗后神经功能评分均较治疗前显著提高，3例无明显疗效。

胚胎干细胞：ESCs是一种全能分化细胞，囊胚中分离培养出ESCs。ESCs在体外可以无限增殖并且能够分化成为骨细胞、皮肤细胞、成纤维细胞等多种组织来源的细胞[11]。在一定生物和化学条件的激励下，ESCs甚至能分化为前体神经细胞，并能逐渐分化为具有功能的神经元细胞，以及多种类型的神经胶质细胞。胚胎来源神经干细胞被认为是脑出血治疗最具有前景的细胞来源之一，然而其致瘤性较其他干细胞高，并且伦理问题较复杂，因此其临床应用也受到很大限制。卢旺盛等[12]在局部麻醉的下，采用立体定位技术，将源自健康母体自然流产的胎儿的神经干细胞植入病变区域，随访结果发现术后6个月，患者临床症状改善率达到了81.25%。刘士东等[13]同样也对颅内血肿患者在清除血肿后植入胚胎干细胞，患者术后第3个月的运动功能吞咽功能等均有改善。

3 干细胞治疗脑出血的不同移植方式、治疗时间

3.1 移植方式

干细胞体内移植可通过以下四种方式实现：（1）静脉滴注、颈内动脉内注入移植；（2）立体定向靶点注射；（3）侧脑室干细胞移植；（4）蛛网膜下腔穿刺注射。然而静脉输入的方式最适合临床应用，因为其侵袭性最小，但可能存在干细胞播散全身多个器官，及潜在肝脏毒性，造成到达脑组织损伤部位的细胞数量急剧减少，并且静脉滴注过快有引起一过性脑缺血和栓塞等危险。立体定向靶点注射有一定的侵袭性，易损伤局部正常脑组织，注入脑实质可很快产生占位副作用，并且局部干细胞浓度过高，不利于分化，患者不易接受，限制了其临床推广。侵袭性较小的方式还有蛛网膜下腔移植，这种方式能有效逃避血脑屏障的阻隔，每次治疗移植细胞数量也相对少，但易感染及继发颅高压风险。

3.2 移植时间

目前研究表明移植的多种干细胞在各种脑出血模型中均能成活并发挥作用，但至今尚没有系统性分析研究关于移植时间对功能恢复的影响。关于干细胞治疗脑出血的时机亦有不同观点。

（1）急性期干预：急性期脑组织损伤后，损伤区域会迅速分泌的各类炎性介质、兴奋性毒性神经递质，甚至产生大量氧自由基等，影响干细胞正常生存的微环境，限制了干细胞的存活、增殖和分化潜能；其次脑出血急性期损伤部位血循环障碍，以及急性期神经营养因子分泌水平较低，也极大的影响干细胞移植成功率。同时又有学者认为：脑出血早期，脑组织本身存在内源性修复机制，且能够在早期发挥一定作用[14]。有报道显示脑出血1d后植入NSCs显示出较好的存活率。徐德才等[15]采用大鼠脑出血成模后第48小时移植BMSCs，结果显示，细胞移植后可明显改善大鼠脑出血后神经功能的恢复，认为BMSCs治疗大鼠脑出血的一个重要潜在机制是其显著减轻损伤脑组织周围早期炎症反应，晚期移植可能效果欠佳。

（2）亚急性期干预：有研究认为急性期成活率低于亚急性期或晚期，Haas等[16]发现卒中后3周左右进行细胞移植，移植的细胞存活率最高。杨郁野等[17]认为：脑出血造成出血区域的神经递质、微环境发生剧烈变化，一些炎症因子及氧自由基等对移植进去的干细胞存活不利，故建议对患者进行血肿引流，待引流充分，拔除引流管前进行移植。

（3）恢复期干预：在恢复期可以避免急性期毒性神经递质及自由基等物质对干细胞的损伤，故选择在脑出血病程第2～6个月进行移植，结果证实在此时间窗进行移植，疗效确切肯定。轻度到重度的颅脑创伤半年以内均可以进行神经干细胞移植，多个研究表明其临床效果良好。此外，移植时间窗的选择必须考虑到脑损伤的自然恢复过程，刻意延长移植的等待时间，可能使得病灶处胶质瘢痕增生明显，影响干细胞有效的迁移至损伤区域，但是最晚移植时间尚需进一步探讨。

在细胞移植的过程中，移植的细胞数量也是临床需要考虑的一个重要因素。将1×106和2×106个MSCs经尾静脉分别注入大鼠体内发现，2×106移植组大鼠运动功能显著优于1×106移植组，这也提示MSCs细胞移植数量也影响着治疗效果。

4 干细胞移植治疗脑出血已知和可能的机制

关于干细胞移植如何修复脑功能损伤，其机制至今仍不确定，可能这些因素相关：（1）替代及修复作用：移植后激活内源性神经干细胞增殖并分化为神经元标志的细胞，外源性干细胞受到周围微环境诱导而增殖，分化。分化成与神经细胞类似的细胞形态和功能，逐渐替代丢失的神经细胞并参与神经功能修复重建，甚至同原有神经细胞建立起功能性突触联系。（2）分泌多种神经生长促进因子：干细胞移植在损伤脑组织局部能条件性的分泌多种神经生长促进因子，包括碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、脑源性神经生长因子等。还能通过促进血管新生，增加损伤区域的血流供应，为受损组织和神经元提供氧气和营养物质。（3）抗炎和免疫调节作用：将脂肪来源的MSCs用来治疗大鼠脑出血，结果显示损伤灶炎症反应在很早期就有明显减轻，髓过氧化物酶+性细胞数在出血灶周围脑组织中显著减少。

5 干细胞治疗脑出血的优势和面临的问题

虽然目前研究显示干细胞移植在脑出血治疗方面临床效果明显，但是临床实际操作中仍然存留许多问题有待解决：如干细胞的来源、移植部位、移植时机、移植途径、移植细胞数量、如何有效稳定地激活内源性NSCs改善神经功能等没有统一规范，且干细胞移植治疗脑出血的远期疗效和潜在风险均有待于进一步评估。李计成等[18]将20例患者的自体骨髓间充质干细胞通过蛛网膜下腔注射方式行移植，在移植前和移植后180天采用NIHSS评分和日常生活活动能力Barthel指数对患者神经功能缺损程度进行评价，同期随访血常规、生化全项、肿瘤标记物等，发现使用自体骨髓间充质干细胞在脑出血临床治疗方面疗效有效，安全性好，近期临床效果显著，而远期临床效果还有待进一步的随访研究。2例患者在移植后出现一过性发热，这可能与单核巨噬细胞释放致热源有关，还有可能的原因则是无菌操作流程的问题。将患者自体骨髓间充质干细胞先在体外诱导成神经干细胞，然后诱导的细胞移植到原手术区脑软化灶与正常脑组织交界处以及脑软化灶的中央部位，并行颅骨修补，结果接受治疗的3例患者语言功能、偏瘫侧肢体运动功能都有好转，尤其是偏瘫测肢体的肌张力较前明显降低，干细胞脑移植患者颅脑MRI图像也表明脑软化灶有缩小趋势，并且干细胞移植区未见“成瘤”[19-20]。有研究将胚胎干细胞用于治疗脑出血，患者在移植后有出现发热等不良反应，但都通过休息和对症治疗后完全恢复。有学者用自体骨髓间充质干细胞治疗脑出血，其中有一个患者仅CA-153略有升高，因此干细胞移植以后的短期内的临床治疗效果得到了证实，但远期效果有待更长时间的随访研究[21]。

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Progress in clinical research of stem cells in the treatment of nerve function injury after intracerebral hemorrhage

GUO Xianli1,2ZHANG Junyi2WANG Jianjun2WANG Shaobo2ZHANG Lixin2
1.Inner Mongolia Medical University,Hohhot,010110,China;2.Erdos Central Hospital Affiliated to Inner Mongolia Medical University,Erdos 017000,China

Cerebral hemorrhage often causes necrosis and apoptosis of nerve cells,which has serious influence to outcome function of patients.The clinical treatment of cerebral hemorrhage is usually conservative or surgical removal of hematoma.However,it is not a good solution to control the clinical treatment of nerve cell loss.Stem cells,in particular, neural stem cells have self renewal and multi differentiation potential,which brings hope to the repair of nerve damage.This article reviews the clinical effect and potential mechanism of endogenous and exogenous neural stem cell transplantation in the treatment of cerebral hemorrhage to provide reference for the study of cerebral hemorrhage.

Stem cell;Cerebral hemorrhage;Repair;Transplantation

R277.7

A

2095-0616（2016）21-45-04

2016-09-02）

▲通讯作者