局灶性脑缺血动物模型的研究进展

孟胜喜，霍清萍



局灶性脑缺血动物模型的研究进展

孟胜喜，霍清萍

上海交通大学附属第六人民医院(上海 200233)

摘要：局灶性脑缺血动物模型对于研究缺血性脑血管病发生、发展的病理生理学机制尤为重要。本研究概述局灶性脑缺血动物模型的动物选择、建模方法、模型改良方法以及最新研究进展。

关键词：局灶性脑缺血；动物模型；建模方法；病理生理

脑血管疾病(cerebral vasculardiseas，CVD)是严重危害人类健康的三大疾病之一，也是导致人类死亡的第二大疾病[1]，其发生率、致残率及死亡率均高，给社会和家庭带来沉重负担[2]。所有CVD中，缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)占80%[3]。脑缺血动物模型对于探究ICVD机制和防治非常重要，它分为弥漫性脑缺血模型和局灶性脑缺血模型。前者对周身影响较大，梗死不稳定，应用较少。后者可形成特定部位的脑梗死并可再灌注，对周身影响不大，类似人发病情况，是模拟和研究ICVD的重要工具。国际脑血管病委员会一致认为ICVD研究应以局灶性脑缺血模型为基础，并对局灶性脑缺血模型提出了明确要求[4]。近些年来，局灶性脑缺血动物模型的造模方法不断改进和发展，对于研究ICVD发生、发展的病理生理学机制极为重要[5]。

1局灶性脑缺血动物模型的动物选择

据文献报道，局灶性脑缺血模型动物有狒狒、猴、猪、狗、猫、家兔、鼠等。狒狒和猴的高级神经中枢与人非常相近，但费用高、来源不易、饲养难。猪的脑血管形态、生理特征和代谢等方面与人相似，侧支循环少，但体型大，品系不纯。狗的脑血管与人差异较大，其颈内外动脉间吻合网较丰富，单根颅内动脉阻断难以形成稳定的脑梗死灶。猫的神经系统较发达，较易建立脑梗死模型。家兔饲养较易，但大脑皮质不够发达，效果不甚理想。啮齿类动物鼠成本低，饲养易，繁殖快，是目前最常用的研究动物[6]。其中大鼠基因与人有98%同源性，脑血管解剖特点与人比较接近[7]，种系内纯性高，同系间遗传差异不大，被广泛用于实验研究。

2常用局灶性脑缺血动物模型制作方法

大多数局灶性脑缺血模型都是阻断大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)造模。85%的ICVD是由MCAO引起[8]，因此MCAO模型普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型。该模型制作方法一般包括线栓法、开颅物理阻断血流法、光化学诱导血栓形成法、血栓形成法、内皮素-1灌注诱导血管收缩法、颈总动脉(CCA)加压夹闭法、负电流电解损伤法、FeCl3化学诱导法及其他。

2.1线栓法线栓法一般不开颅，易操作，损伤不大及对生理指标影响也不大[9]，是目前应用最广泛的局灶性脑缺血模型造模方法，由Koizumi首创[10]。操作如下：分离大鼠一侧CCA、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，结扎、切断颈外动脉及分支，结扎翼腭动脉，把来自颅外的侧支循环阻断，从颈外动脉残端插入顶端粘有硅橡胶的尼龙单丝线，沿颈外动脉、颈总动脉连接部和颈内动脉缓慢前进，至颈内动脉颅内连接部时即可阻断大脑中动脉(MCA)血流。若大鼠苏醒后出现同侧的Horner征和对侧前肢为重的偏瘫，则表明造模成功。Longa等[11]把顶端烫成光滑圆球的4-0单尼龙线作为栓塞物，也可制成相应动物模型，并可准确控制脑缺血再灌注时间；同时创建了用于评价大鼠神经功能缺损程度的Longa评分。Laing等[12]比较Koizumi法与Longa法，认为Koizumi法比Longa法的梗死效果更好，模型成功率更高。1994年Huang等[13]用线栓法制作了出小鼠局灶性脑缺血模型。1997年Hara等[14]用改良线栓法制作小鼠急性局灶性脑缺血模型，即线栓阻断小鼠左侧MCA后进行再灌注，使脑梗死体积减少约44%，提高了其存活率。李冠华等[15]应用线栓阻断大鼠左侧MCA后再进行再灌注，制作了大鼠局灶性脑缺血模型，成活率约67%。Zuo等[16]用石蜡涂层线栓建立大鼠MCA永久性闭塞模型，成功率达100%，而使用无石蜡涂层的线栓，成功率仅有55%。使用石蜡涂层线栓造模的脑梗死体积比普通尼龙线栓更大，死亡率更低。

线栓法在实验中不断改进和完善。目前用尼龙钓鱼线代替4-0缝线，用动脉夹夹闭来代替结扎翼腭动脉[17]。曹霞等[18]将聚乙烯醇处理后的大鼠自体鼠须作为栓塞材料；刘运泉等[19]采用硅橡胶和多聚赖氨酸处理线栓，使其头端光滑圆钝，两者均提高了造模成功率。王桥生等[20]在Longa法基础上予以改进，从右侧胸锁乳突肌内侧和胸骨舌骨肌之间的肌间隙暴露颈动脉鞘，稍分离即可见到CCA、ECA和ICA，在分离颈动脉叉和周围神经组织时，在CCA上置一打单结的5-0缝合线，将传统自ECA进栓线改从CCA进栓线。李艳红等[21]用丝线结扎翼腭动脉，但不结扎CCA，使CCA-ICA血行畅通，从而提高模型的成功率和稳定性。包新杰等[22]分离与CCA伴行的迷走神经和迷走神经节，并加以保护，避免在牵拉血管时，损伤迷走神经，提高了存活率。贾淑伟等[23]发现术前禁食可降低造模动物死亡率，按大鼠体重选择相应直径的栓线可提高造模成功率。沈斌等[24]认为严格控制脑血流量、夹闭对侧CCA、选择合适栓线等，是提高成功率的关键。辛世萌等[25]利用析因设计，通过评价神经功能缺陷程度和脑梗死体积，发现最佳造模方案是大鼠体重250 g～300 g、栓线长17 mm或18 mm、栓线直径0.28 mm。臧志萍等[26]认为小鼠局灶性脑缺血模型造模术后的成活率、脑梗死体积、神经行为学表现和手术方法存在相关性。闫峰等[27]应用神经介入微导丝导管技术，建立一种改良的家兔MCAO模型。刘学军等[28]通过兔局灶性脑缺血再灌注模型实验发现，针对不同体重动物而选择相应大小头径的线栓，可获得较高的成功率，而插线深度不正确则为造模失败的主要原因。李雪丽等[29]认为体重250 g～350 g大鼠，理想线栓长度应为17 mm～18 mm，线栓直径应为0.25 mm～0.28 mm。张秋玲[30]采用韩国产3号圆柱形尼龙钓鱼线，将其一端覆以少许乙醇稀释指甲油，使得插线前端光滑且无明显膨大，造模效果较满。刘运泉等[31]在线栓头部覆以左旋多聚赖氨酸，增加了缺血的稳定性，保证缺血效果。王耀明等[32]采用固体石蜡经加热熔化后处理栓线，操作简便，具有较好的一致性。动物的品系和体重、尼龙线粗细及头端大小、插线深度的不同等均可导致线栓法制备的模型在成功率、梗死体积、蛛网膜下腔出血发生率、动物早期死亡率等方面存在一定的差异[33]。

2.2开颅物理阻断血流法1981年Tamura等[34]首先建立该模型，后不断改进。开颅部位尽可能在需阻断血管位置的后面，经颅骨较薄或者缺损的部位进行，尽量减少损伤。方法有以下三种：①通过颞下部入颅，可分离看到横过嗅束内缘或外缘的MCA；②通过眶部入颅[35]，沿眶上缘作弧形切口，分离眶内结缔组织，视神经孔可见，电凝切断视神经，于视神经孔外上方开窗，切开硬脑膜，便可找到MCA。张运周等[36]在O’ Brien方法基础上进一步改进：骨窗在视神经孔的外上方，每次均在MCA主干末端电凝闭塞，略加游离MCA后电凝闭塞MCA，夹闭MCA；③通过眶后进颅[37]：在距眶外沿纵形切开，分离眼轮匝肌、颞肌，从视神经孔外沿钻颅骨，除去相邻颞骨及部分蝶骨翼，切开硬膜后见MCA主干。

开颅后阻断血管可用电凝、结扎和夹闭等方法。电凝比结扎操作简单，但引起的脑组织水肿和局部创伤程度均明显大于结扎；使用血管夹夹闭血管，操作简单，对血管损伤较小，又能制作缺血再灌注模型。金荣等[38]采用微动脉夹夹闭一侧大脑中动脉和双侧颈总动脉的方法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。Kaplan等[39]以金属牵引钩牵拉MCA，从而制作局灶性脑缺血再灌注模型。

2.3血栓形成法

2.3.1光化学诱导法由Waston等[40]于1985年首创，将一定量的孟加拉红注射入动物机体后，以特定光照射，二者在血管内发生光化学反应，大量活性氧随之产生，损伤血管内皮细胞，进而血小板黏附、聚集，血栓形成，进一步形成血栓性脑梗死。Suzuki等[41]则从颞部开颅，直接对大脑中动脉照射。Dietrich等[42]给大鼠静脉注射玫瑰红B，用光化学反应产生氧自由基，破坏血管内皮，血小板聚集形成血栓，以光束经颅骨表面照射鼠脑特定部位，造成血栓性梗死模型。之后开颅选择MCA起始端进行光照诱导MCA闭塞方法，并在光照血管的局部滴注尼莫地平，使血管再通，从而制作出局灶性脑缺血再灌注模型。王伟等[43]以Bederson法[44]为基础，分步照射MCA起始端、嗅束内侧至大脑下静脉交叉处的一段MCP，闭塞MCA近端，阻断豆纹动脉，在额顶叶皮质和基底核外侧形成梗死灶。李树清等[45]在大鼠尾静脉内注入孟加拉红后，置于氙灯辐照系统内，制作出局灶性脑缺血再灌注模型。杨渊等[46]制作了光化学诱导的老年大鼠局灶脑梗死模型，此模型适合研究老年脑血管病病人相关基因及干预治疗。朱华等[47]首次把光化学法应用于灵长类动物，成功地制作了食蟹猴局部脑缺血模型。光化学诱导血栓形成，缺血性脑损伤系统和凝血纤溶系统均参与其中，因此脑组织病理损害程度较其他脑缺血动物模型更为明显[48]。

2.3.2微栓子栓塞法从ICA系统引入栓子从而阻断MCA血流。栓子可分为：①永久性栓塞栓子，如硅胶柱稳定地阻塞MCA；②不稳定再灌注栓子，如自体凝血块。沈顺姬等[49]将鼠尾静脉的血推入微导管中，制成血栓，再将此导管从ECA逆行插入到与ICA相交处，把栓子推入ICA而制成大鼠脑缺血模型；③稳定再灌注栓子，即带软线的栓子，可人为精确控制缺血再灌注时间[50]。另外，Toshima等[51]从ICA注入月桂酸钠，选择性地损伤大脑穿支动脉内膜，导致血小板黏附、聚集、血栓形成，从而成功地复制腔隙性脑梗死。王俊涛等[52]采用中药白芨微粒作为栓塞剂建立大鼠局灶性脑缺血模型。Zhang等[53]经导管介导，用凝血酶诱导血栓形成，该血栓与人体血栓成分相近，且选择梗塞MCA起始部，可以比较接近地模仿人血栓形成过程。与Zhang方法类似的有铜线栓子诱导的血栓形成[54]，硅酮微球、碳粒微球等作为栓子制成局灶性脑缺血模型。

2.4内皮素-1灌注诱导血管收缩法内皮素-1(Endotheline-1，ET-1)由内皮细胞产生，是迄今为止发现作用最强的血管收缩活性物质。在中枢神经系统中，ET-1通过强烈持续的血管收缩作用，使局部脑血流量(iCBF)减少，形成梗死灶，还可通过直接损伤神经细胞、胶质细胞而诱发卒中。Macrae等[55]于MCA近端表面滴加ET-1后，发现脑血流量呈剂量依赖性减少，并产生脑梗死，还伴随缺血出现缓慢进展的再灌注。Fuxe等[56]在大鼠一侧纹状体内注射微量ET-1后，导致缺血性脑损害和半暗带形成。Sharkey等[57]经定向导管向大鼠的MCA管腔周围的脑实质内灌注微量ET-1后平均动脉压可增加20%，MCA供应区iCBF减少93%以上，还产生类似于MCA永久闭塞后的缺血性脑损害表现。ET-1灌注诱导血管收缩法避免了对血管和脑组织的机械损伤，并可通过改变ET-1的用量或用拮抗剂来控制缺血和再通时间[58]。

2.5CCA加压夹闭法Nishimura等[59]首创此法：实验对象为沙土鼠，在颈正中切口，暴露、分离CCA，把CCA夹于一副未完全切断的聚乙烯管之间并持续若干分钟。此法通过加压夹闭、机械损伤CCA局部内皮，血栓出现快，重复性高。

2.6负电流电解损伤法将不绝缘负电极穿入血管，保证和内膜接触良好，连接负电极与一个双道方波产生器的正极，电流损伤血管内皮细胞，引发血栓形成，阻塞血管腔，使脑血流量减少造成脑缺血。

2.7FeCl3化学诱导法该法是一种原位血栓形成的方法[60]，即用化学物质FeCl3局部浸润动脉，可使血管内膜剥脱、内膜下组织暴露，从而引起动脉内血栓形成。刘小光等[61]开颅显露位于嗅束和大脑下静脉之间的一段MCA，将FeCl3溶液的小片滤纸贴于该段血管上，术后24 h可形成混合血栓，随之形成脑梗死灶。

3其他

3.1圈套器结扎模型[62]使用圈套器结扎大脑中动脉或松解圈套器，阻断血流或再灌注。该法常用于猫及灵长类动物的研究。

3.2转基因和基因敲除模型转基因和基因敲除鼠为缺血和再灌注细胞损伤及神经保护机制中相关基因和蛋白质的研究提供新方法[63]。线栓法也可用于转基因或基因敲除小鼠[64]。

3.3皮层压迫法[65]在初级躯体感觉皮质对应的颅骨处钻一小孔，保持硬脑膜完整，然后用装有激光多普勒探头的铜柱小合压迫硬脑膜，从而形成脑梗死灶。

3.4球囊导管法该法可认为是线栓法的改进， Hamberg等[66]将血管入口选在股动脉，球囊导管经升主动脉到CCA，然后经ICA入颅，通过MCA球囊扩张或缩小达到阻断或恢复血流目的。Jungreis等[67]进行改进，在血管内用导丝阻断MCA和用球囊可逆的阻断ICA，形成脑梗死灶。

4小结

综上所述，近几十年来，国内外学者对局灶性脑缺血模型从动物的选择、模型的分类及方法制备等方面进行有益探索和不断完善，明显提高了模型的成功率和脑梗死灶的稳定性，使得局灶性脑梗死模型制作日趋成熟和完善。在今后的研究中，不仅应重视缺血损伤的可控性和重复性，严格控制各种干扰因素，尽量减少其对实验结果的影响，还应从实验动物、模型选择、实验条件、实验流程、评价指标与测试等方面构建一系列统一的标准体系，使得实验方法和实验流程等方面进一步科学化、标准化、规范化，为ICVD科学研究提供更有力的工具和手段。同时应积极尝试和构建病证结合脑缺血动物模型，为中医研究脑血管疾病提供良好的实验基础，为中医药对ICVD防治作用的评价提供客观依据。

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(本文编辑薛妮)

基金项目：上海市科委中医类引导项目(No.15401933300)；上海市卫计委项目(No.YSNXD-YL-YSZK013)

通讯作者：霍清萍，E-mail：huoqingping005@163.com

中图分类号：R743R255.2

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．12．019

文章编号：1672-1349(2016)12-1366-05

Corresponding Author：Huo Qingping

(收稿日期：2015-08-09)

Research Progress on Animal Model with Focal Cerebral Ischemia

Meng Shengxi，Huo Qingping

Shanghai Sixth People’s Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200233，China

Abstract：The animal model of focal cerebral ischemia plays an important role in the investigation of pathophysiology， pathogenesis of ischemic cerebrovascular disease.The paper summarizes animal selection，modeling method，model improvement method and the latest research progress of focal cerebral ischemia animal model and so on.

Key words：focal cerebral ischemia；animal model；modeling methods；pathophysiology