高效凝胶色谱法测定太子参均一多糖分子量

史文涛庞文生胡　娟，2*.福建中医药大学药学院，福建　福州　35022; 2.福建省中医药研究院，福建　福州　350003

高效凝胶色谱法测定太子参均一多糖分子量

史文涛1庞文生1胡娟1，2*
1.福建中医药大学药学院，福建福州350122; 2.福建省中医药研究院，福建福州350003

【摘要】目的:建立太子参均一多糖的分子量分析方法.方法:应用高效凝胶渗透色谱法，色谱柱为Waters UltrahydrogelTM1000(7. 8×300mm)GPC柱，流动相为0. 1mol/L硝酸钠溶液，柱温35℃，示差折光检测器(检测器温度35℃)，流速0. 6ml/min.结果:根据建立的方法测定，得到多糖的高效凝胶色谱图，计算出太子参均一多糖分子量为22374Da.结论:方法准确可行，为太子参均一多糖分子量的测定提供了科学依据.

【关键词】高效凝胶色谱法;太子参均一多糖;分子量

Determination of Molecular Size of Pseudostellaria heterophylla polysaccharide by HPGPC

SHI Weng-tao1，PANG Weng-sheng1，HU Juan1，2*
1. FuJian University of Traditional Chinese Medicine of Pharmacy，Fuzhou 350122，China;
2. Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China

Abstract:Objective To develop a method for determining the molecular weight of Pseudostellaria heterophylla polysaccharide．Methods To develop a simple High Performance Gel Permeation Chromatography(HPGPC)method，Waters UltrahydrogelTM1000(7. 8×300 mm)GPC column was used with 0. 1mol/L Sodium nitrate as the mobile phase with a flow rate of 0. 6ml/min．The column temperature was maintained at 30℃and the differential refractometer detector was used(The detector temperature 35℃)．Results According to the method the molecular mass of the radix pseudostellariae polysaccharide is 22374 Da．Conclusion The method is simple，precise and has been used for the analysis of the polysaecharids from Radix pseudostellariae polysaccharide．

Key words:HPGPC; Pseudostellaria heterophylla polysaccharide; molecular weight

太子参多糖具有增强机体免疫、润肺镇咳、降低血糖、改善胰岛素抵抗等作用，是一类重要的活性成分[1－3].多糖为单糖的天然聚合物，性质和药理作用与其分子量大小密切相关.本课题组前期研究，不同分子量太子参多糖能够显著降低高脂高糖和链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠空腹血糖，改善糖耐量和胰岛素耐量，其中分子量范围约在50～210KDa的太子参多糖降糖效果最佳，且能缓解高血糖高血脂症状，改善胰岛素抵抗[4].在此基础上，对该分子量段太子参多糖进行分离纯化，获得均一多糖.高效凝胶色谱(HPGPC)法测定多糖的分子量，具有快速、重现性好等优点，在国内外得到了广泛的应用[5].本文应用HPGPC方法对分离出的太子参均一多糖进行分子量测定.为太子参多糖分子量大小与药理作用的相关性研究积累科学数据.

1　仪器与材料

1. 1仪器Waters2695高效液相系统; Waters RID2414型示差折光检测器; Waters UltrahydrogelTM1000(7. 8mm× 300mm)GPC柱.

1. 2试剂与材料太子参多糖(本课题组自制); Dextran系列葡聚糖分子量标准对照品(Pharmacia)T－2000、T－500、T－70、T－40、T－10;硝酸钠(国药化学试剂)，AR级;水为超纯水.

2　方法与结果

2. 1色谱条件色谱柱为Waters UltrahydrogelTM1000(7. 8 ×300mm)GPC柱，流动相: 0. 1 mol/L硝酸钠溶液;柱温: 35℃;检测器: Waters RID2414型示差折光检测器(检测器温度35℃);流速: 0. 6 ml/min，进样50μl.

2.2溶液的制备称取太子参多糖适量，用流动相配成2.5 mg/ml的溶液作为供试品溶液.另取分子量已知的Dextran系列标准葡聚糖T－2000、T－500、T－70、T－40、T－10同法制成2.5 mg/ml的溶液.溶液使用前用0.45 μm微孔过滤膜过滤.

2. 3流动相的离子强度的影响本实验分别考察了浓度为0. 05、0. 1、0. 2、0. 3mol/L的硝酸钠溶液对太子参多糖色谱行为的影响.结果表明:当流动相的浓度较低时，洗脱能力变弱，多糖无法洗脱下来.当流动相浓度为0. 1mol/L时，出峰时间和峰面积均表现出良好的重复性，而且峰形对称，所以最终选择流动相的浓度为0. 1 mol/L.太子参多糖HPGPC图谱见图1.

2. 4样品的浓度及进样量的影响在最佳流动相浓度下分别考察样品浓度1mg/ml进样50μl，2. 5mg/ml进样20μl，2. 5mg/ml进样50μl.结果表明:样品1mg/ml进样50μl的条件下出峰时间和峰面积均表现出良好的重复性，而且峰形对称，因此确定最佳色谱条件:流动相为0. 1mol/L硝酸钠溶液，样品浓度为1mg/ml，进样50μl.

2. 5标准曲线的绘制已知分子量的标准葡聚糖溶液按上述最佳色谱条件测定，测定结果见表1.将标准葡聚糖分子量的对数logM对保留时间tR进行回归处理，得线性回归方程为logM =－0. 4315tR+10. 808，R2=0. 9955.

图1　太子参多糖HPGPC色谱图

表1　葡聚糖分子量标准对照品保留时间及其相应的对数值

2. 6样品测定结果太子参多糖在相同色谱条件下进样分析，HPGPC图谱见图1，保留时间为14. 967min，通过回归方程计算得出太子参多糖的分子量为22374Da.

3　讨论

根据以上测定结果可见，测定的太子参多糖的分子量为22374Da.本实验建立了一种测定太子参多糖的体积排阻色谱方法，其具有简便快捷、操作方便等优点，为太子参多糖的进一步分析提供了检测手段.

参考文献

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[2]Wengsheng Pang，Siding Ling，Qiwen Dai，et al．Anti－tussive Active of Pseudostellaria heterophylla(Miq．)Pax Extracts and Improvent in Lung Function via Adjustment of Multi－Cytokine Levels[J]．Molecules，2011，16: 3360 －3370．

[3]倪受东，夏伦祝，徐先祥，等．太子参多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠的治疗作用[J]．安徽医药，2010，14(5): 521－522．

[4]Juan Hu，Wengsheng Pang，Jinlong Chen，et al．Hypoglycemic effect of polysaccharides with different molecular weight of Pseudostellaria heterophylla[J]．BMC Complementary and Alternative Medicine，2013，13: 267

[5]董晓蓉．高效液相色谱法测定蔗糖铁注射液中蔗糖铁的分子量与分子量分布[J]．药物鉴定，2006，15(4): 19－21．

收稿日期:( 2014. 10. 18)

通信作者:胡娟，E－mail: huj@ fjtcm. edu. cn

作者简介:史文涛，男，在读硕士研究生，从事中药活性成分及质量标准研究.E－mail: 857295972@ qq. com

基金项目::国家自然科学基金资助项目(81470175).福建省中医药研究院自主选题资助项目2013fjzyyk－2.

【文章编号】1007－8517(2015)02－0020－02

【文献标志码】A

【中图分类号】R284. 1