急性髓细胞白血病 FLT3-ITD融合基因突变及其研究进展

杨 杨，任建新，卢振霞

(吉林大学中日联谊医院 肿瘤血液内科，吉林 长春130033)

*通讯作者

急性髓细胞白血病 FLT3-ITD融合基因突变及其研究进展

杨 杨，任建新，卢振霞*

(吉林大学中日联谊医院 肿瘤血液内科，吉林 长春130033)

急性髓细胞白血病(acute myeloid luekmia，AML)是造血干细胞恶性克隆性疾病。几乎所有刺激细胞增殖的生长因子信号都是通过酪氨酸激酶受体通路传导的，其在白血病细胞增殖中起到了重要的作用。

1 FLT3-ITD分子结构特点

Fms样酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase3,FLT3)是原癌基因，位于染色体13q12，属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族.。近来研究发现FLT3基因的异常表达、突变与AML的发生、发展预后有密切的关系[1]。酪氨酸激酶受体基因FLT3的内部串联重复序列(FLT3 internal tandem duplications,FLT3-ITD)是一种近膜区的突变，称为FLT3-ITD，由Nakao等[2]首先报道。FLT3-ITD突变主要集中在FLT3基因的14至15外显子而ITD突变导致FLT3受体的持续自身磷酸化，与其配体结合后经二聚体化和自身磷酸化被完全激活[3]，并激活下游RAS/MAPK、P13K通路，同时有STAT5通路的短暂激活。FLT3-ITD突变持续激活这些信号通路，并通过内质网中形成的不成熟受体激活STAT5通路。FLT3-ITD突变不依赖生长因子，其形成第一个胞内酪氨酸结构域自主磷酸化，激活Ras和STAT5途径使造血细胞活化和自我增殖，导致AML发病及复发。研究表明FLT3-ITD在疾病过程中是不稳定的，与疾病状态有关，完全缓解后FLT3-ITD可以是阴性的，复发后则可以再次转为阳性[4]。近年由于全基因组测序分析提出新的观点，FLT3-ITD作为驱动突变与白血病发生及靶向治疗有关，之后发生的其他协同突变与疾病进展有关[5]。

2 FLT3-ITD及FLT3的临床特征

在FAB亚型中，FLT3-ITD突变在M3的阳性率最高，M5次之，M2、M6、M7的阳性率较低。外周血白细胞和骨髓中白血病细胞明显增高的初治AML常伴FLT3-ITD突变[6]。FLT3-ITD突变在AML中是独立预后不良的因素。FLT3 mRNA几乎在所有AML患者中均阳性，在FAB分型中，其在M5最高，M3最低，可能与FLT3的主要作用是促增殖而M3以分化障碍为主[7]。在AML中，FLT3及其受体通过自分泌及旁分泌促进异常克隆细胞的增殖和维持。因此，FLT3与AML外周血白细胞计数存在相关性，FLT3表达越高，白细胞计数越高。

目前白血病的完全缓解率有很大提高，但缓解后复发仍是治疗难题。微小残留病(minimal residual disease,MRD)与白血病的复发密切相关。MRD指白血病经过治疗完全缓解后残留在体内少量的白血病细胞。检测MRD是白血病治疗的另一个重要措施，可以早期预测复发，指导临床个体化治疗。以往研究显示FLT3-ITD突变不稳定，不适用于MRD的监测[8]。但采用串联聚合酶链反应(tandem duplication polymerase chain reation,TD-PCR)监测FLT3-ITD突变的移植后患者复发较PCR更敏感。应用TD-PCR可能使FLT3-ITD成为监测MRD的敏感指标[9]。最新研究表明，第二代测序法(Next-generation sequencing， NGS)克服了基因诊断技术难题。敏感的NGS可以区分多克隆及复杂的多基因突变，并能定量突变基因[10]。因此NGS可以检测到AML患者疾病过程中的FLT3突变，即使是存在复杂突变。超深焦磷酸测序(amplicon-based ultra-deep sequencing，UDS )技术可以在初治FLT3-ITD阴性的患者进展或复发时检测到FLT3-ITD突变，用UDS方法回顾这些患者FLT3-ITD状态，可以检测少量的ITD阳性克隆，这是普通方法检测不到的[11]。

3 FLT3-ITD突变的AML患者的靶向治疗

AML的发生需要多次基因突变，而多种异常基因从促进细胞增殖、阻碍分化、抑制凋亡、干扰细胞周期等方面作用于粒系干/祖细胞，导致AML的发生、发展。虽初治的AML完全缓解率超过70%，但仅有30%的患者可以长期无病生存。

因分子生物学的发展，发现与AML密切相关的基因，为个体化治疗提供依据。由于FLT3基因与AML发生密切相关，针对FLT3的靶向治疗是研究热点。在悬浮培养中，FLT3-TKI主要是加速FLT3突变细胞系和AML原始细胞的凋亡，可能由于骨髓中产生了配体及其他细胞因子，使骨髓中原始细胞的凋亡较少[12]。所以应用FLT3抑制剂诱导FLT3-ITD突变的白血病细胞凋亡，抑制的程度需要更深入和持久[13]。目前多种FLT3抑制剂均为杂环化合物，具有腺苷嘌呤环的相似结构，可以插入FLT3的ATP结合位点，阻止其磷酸化。第一代FLT3酪氨酸激酶抑制剂特异性差，即使是第二代FLT3抑制剂，最初也是抑制其他受体的，所以第一二代FLT3抑制剂疗效差。Quizartinib(AC220)认为是首个特异性靶向作用于FLT3的抑制剂[14]。AC220比第一二代的FLT3酪氨酸抑制剂有更确切的疗效及特异性。更重要的是其显著的临床效果可能改变FLT3突变的AML的治疗结果。

AC220的结果，Quizartinib可作为FLT3抑制剂治疗FLT3-ITD突变的AML[15]。Quizartinib一期临床应用于难治、复发的AML患者中。研究终点是Quizartinib的安全性、耐受性和药动力学[16]。患者最初口服Quizartinib 12mg/天，口服2周后间歇2周，然后持续口服。76名患者入组，17(22%)名患者有FLT3-ITD突变，37(49%)个无FLT3-ITD突变，22个未检测FLT3-ITD。持续用药的最大耐受剂量为200 mg/天，剂量限制性毒副作用主要是无症状的心脏复极间歇延长，表现在QT间期延长；其他3/4级毒副作用主要是贫血、血小板减少、疲劳。23例出现治疗反应，其中包括2个完全缓解(CR)，3个完全缓解伴血小板未完全恢复(CRp)，5个完全缓解伴血象未完全恢复(CRi)，13个部分缓解。中位反应时间是13.3周，中位生存期14周。在试验中，Quizartinib在预后不良的患者中有较高的反应率且耐受性良好。所以持续200 mg/天的最大耐受剂量作为Ⅱ期临床的剂量。随之Quizartinib I期临床，已开放Quizartinib 5个临床研究。其中最大的一个临床研究是单独应用Quizartinib治疗难治、复发的AML患者。入组62个患者，男性剂量135 mg/天，女性剂量90 mg/天，剂量减量是由于无症状、不可逆的QT间期延长发生率较高。应用改良的方案，2组患者入组[17-18]。第一组入组133名患者，其中92名FLT3-ITD突变阳性，41名无突变，入组患者年纪≥60岁，均是初治难治或是第一次复发。FLT3-ITD突变阳性的患者，治疗的完全缓解率为54%(0CR;3%CRp;51%CRi)，中位治疗反应时间12.7周，中位总生存时间25.3周。FLT3-ITD突变阳性的难治患者达到39%的完全缓解率，阴性的患者完全缓解率为32%(2%CR;2%CRp;27%CRi)。第二组入组年纪较小的患者，99名FLT3-ITD突变阳性患者，38名无突变，均为二线治疗后难治或复发。这一组治疗反应率与第一组相似，FLT3-ITD突变阳性的完全缓解率44%(4%CR;0%CRp;40%CRi)，无FLT3-ITD突变的反应率34%(3%CR;3%CRp;29%CRi)。第二组反应率与第一组相似，但是年轻的CRi患者可以选择异基因造血干细胞移植。

基于Quizartinib I Ⅱ期临床试验中较高缓解率和较轻的毒副作用，使之有望在短期内应用于临床，治疗FLT3-ITD阳性的AML患者。

近期研究表明，T-LAK蛋白源激酶抑制剂(T-LAK cell-originated protein kinase inhibitor，TOPK inhibitor)(OTS514)或可成为FLT3-ITD阳性的AML患者新的治疗方法。TOPK是苏氨酸蛋白激酶，与肿瘤细胞的有丝分裂及增殖有关[19]，其在睾丸及胎儿组织中表达，在其他正常组织几乎不表达，却在一些预后较差的肿瘤表型中高表达；研究表明，TOPK在大部分的AML细胞系中高表达[20]。从3个AML患者中获取白血病细胞，分别用不同剂量的OTS514治疗，发现白血病细胞的凋亡与OTS514剂量相关。而从AML患者及正常人中分别获得CD43+细胞，均应用OTS514，结果发现AML-CD43+增殖明显下降，而正常人CD43+细胞增殖无变化。可见OTS514仅对AML-CD43+有细胞毒作用。由此可见，TOPK抑制剂OTS514可以促白血病细胞凋亡及降低细胞增值能力，但对正常细胞影响较小[21]。

为了明确白血病中是否存在特殊亚型对TOPK抑制剂(OTS514)敏感，选择具有不同分子及细胞遗传突变的10个AML细胞系，分别应用不同剂量的OTS514，结果表明不同亚型的细胞系对OTS514的敏感性不同，有FLT3 突变的细胞系 (MV4-11,MOLM13 and KOCL-48) 较其他细胞系更敏感(Mann-Whitney U test,P=0.016) 。进一步研究 MV4-11 和MOLM13细胞系(有FLT3-ITD 突变并高表达TOPK),U937 (FLT3阴性并表达TOPK),和 KG1 细胞系 (FLT3野生型伴低表达TOPK)，应用OTS514 浓度40nM 48小时，检测到 MV4-11和MOLM13 细胞系凋亡率分别增加80%及70%， U937 和 KG1 细胞系凋亡率仅增加40% 和10% 可见TOPK抑制剂对FLT3突变的白血病细胞有较强抑制作用。

目前关于FLT3-ITD基因研究已经取得巨大的进步，开拓了AML治疗新思路。

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2016-02-15)