色素上皮衍生因子对人肺腺癌SPC-A-1细胞增殖及凋亡的影响

杨福堂，李燕，王淑云(聊城市第二人民医院，山东聊城252601)

色素上皮衍生因子对人肺腺癌SPC-A-1细胞增殖及凋亡的影响

杨福堂，李燕，王淑云
(聊城市第二人民医院，山东聊城252601)

摘要:目的观察色素上皮衍生因子( PEDF)对人肺腺癌SPC-A-1细胞增殖及凋亡的影响，为其临床应用提供依据。方法将对数生长期的人肺腺癌细胞株SPC-A-1随机分为观察组和对照组，观察组分别加入终浓度为180、360、720 nmol/L的PEDF处理24、48、72 h，对照组不添加PEDF。采用MMT法检测两组细胞增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果同一时间点，观察组不同浓度PEDF细胞增殖抑制率、凋亡率均高于对照组( P均＜0.05)。随着PEDF作用时间的延长及浓度的增加，观察组细胞增殖抑制率、凋亡率均逐渐增加( P均＜0.05) ;但干预24 h时，观察组不同浓度PEDF细胞凋亡率比较，P均＞0.05。结论PEDF能抑制人肺腺癌SPC-A-1细胞增殖，并促进其凋亡。

关键词:肺肿瘤;肺腺癌;色素上皮衍生因子;细胞增殖;细胞凋亡

肺癌是临床常见恶性肿瘤，5年生存率不到15%，腺癌是其主要组织学类型［1］。色素上皮衍生因子( PEDF)属于丝氨酸蛋白酶超基因家族，具有抑制新生血管形成及肿瘤细胞浸润、转移的作用，其在肺癌各组织学类型细胞株中均有表达［2～4］。2013 年6月～2014年9月，我们观察了PEDF对人肺腺

癌SPC-A-1细胞增殖及凋亡的影响，为其临床应用提供依据。

1　材料与方法

1.1材料人肺腺癌细胞株SPC-A-1购自上海拜力生物科技有限公司，FBS、DMEM/F12培养液购自北京百奥森泰生物技术有限公司，胰酶、四甲基偶氮唑盐、二甲基亚砜购自美国Sigma公司，PEDF蛋白购自美国Hyclone公司。CO2培养箱购自德国Heraeus公司，酶标仪购自美国BioTek公司，CytoFLEX流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。

1.2细胞培养人肺腺癌细胞株SPC-A-1置于含100 mL/L FBS及2.5 mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中，在37℃、5% CO2细胞培育箱中常规无菌培养。

1.3 PEDF对SPC-A-1细胞增殖抑制作用的观察

将对数生长期的SPC-A-1细胞随机分为观察组和对照组。采用胰酶消化后离心制备单细胞悬液，以每孔5×104/mL接种在96孔板中，加入DMEM/F12培养液，置于培养箱过夜。细胞贴壁后，观察组分别加入终浓度为180、360、720 nmol/L的PEDF，对照组不添加PEDF，观察组每个浓度及对照组均设5个复孔。培养24、48、72 h时分别加入10 μL MTT，继续培养4 h;出现结晶后吸去培养液，加入150 μL二甲基亚砜，摇床震荡10 min;待结晶溶解后，使用酶标仪于570 nm波长处检测各组光密度( OD)值，重复3次。增殖抑制率= ( 1－OD观察组/OD对照组)×100%［5］。

1.4 PEDF对SPC-A-1细胞凋亡作用的观察取对数生长期的SPC-A-1细胞，采用胰酶消化后以2 ×106/mL密度接种于细胞培养瓶中，待细胞贴壁生长后，吸去上清液，将细胞随机分为两组。观察组分别加入终浓度为180、360、720 nmol/L的PEDF，对照组不添加PEDF;观察组每个浓度及对照组均设5个复孔。两组培养24、48、72 h时分别用PBS清洗，再次消化后室温孵育48 h，收集两组细胞，70%乙醇固定30 min; PBS冲洗后加入5 μL Annexin V-FITC 及10 μL PI溶液混匀，置于流式管中，室温避光染色30 min;使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.5统计学方法采用SPSS21.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，多组间比较采用重复测量数据的方差分析，组间两两比较采用SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组细胞增殖抑制率比较同一时间点，观察组的细胞增殖抑制率均高于对照组( P均＜0.05) ;随着PEDF作用时间的延长及浓度的增加，观察组细胞增殖抑制率均逐渐增加( P均＜0.05)。

表1　各组培养24、48、72 h时细胞增殖抑制率比较(珔x±s)

2.2两组细胞凋亡率比较同一时间点，观察组不同浓度PEDF细胞凋亡率均高于对照组( P均＜0.05) ;随着PEDF作用时间的延长及浓度的增加观察组细胞凋亡率均逐渐增加( P均＜0.05)，但干预24 h时，观察组不同浓度PEDF细胞凋亡率比较，P均＞0.05。

表2　各组培养24、48、72 h时细胞凋亡率比较(珔x±s)

3　讨论

研究发现，抑制血管增生可控制肿瘤的发展［6］。血管增生通过内皮细胞迁移及增殖完成，为肿瘤细胞提供营养;同时，血管增生刺激因子与抑制因子平衡紊乱，导致新生血管出现［7］。肿瘤细胞的快速成长有赖于新生血管的形成，并通过新生血管形成肿瘤细胞的转移途径［8］。PEDF是目前发现的最强的血管增生抑制因子，对肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤均有抑制作用。研究发现，PEDF通过Fas通路上调细胞凋亡相关基因表达，并激活胱天蛋白酶信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡［9］;此外，PEDF可抑制毛细血管形成，阻碍内皮细胞迁移［10］。PEDF低表达的肺癌细胞更易发生淋巴结转移，且PEDF表达水平与肺癌分化程度、临床分期及远处转移密切相关，因此检测PEDF有助于判断肺癌病变程度［11］He等［7］研究发现，腺病毒介导的PEDF表达可抑制Lewis肺癌的生长。

本研究发现，PEDF可抑制人肺腺癌SPC-A-1

细胞增殖，且随着PEDF浓度增加、作用时间延长，细胞增殖抑制率逐渐增高。细胞增殖失控是肿瘤形成的重要原因。肿瘤细胞的增殖周期包含G1、S、G2及M期，与细胞增殖关系最为密切的是DNA倍增、染色体复制的S期。如果在S期通过外界因素作用抑制或减慢DNA合成，则会影响细胞周期的进展。PEDF可抑制肿瘤细胞周围新生血管的形成，减少细胞增殖所需蛋白质的合成，使DNA含量较多的S期细胞减少，而DNA含量较少的G1期细胞增多，从而减慢肿瘤细胞周期进程，抑制肿瘤细胞增殖。

本研究还发现，PEDF也具有诱导细胞凋亡的作用，随着PEDF浓度的增加、作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐增高。细胞凋亡是一种主动的、受遗传控制的程序性死亡，PEDF可能通过作用于肿瘤的某些旁路途径，或参与细胞周期的某些重要的酶、蛋白，进而诱导肿瘤细胞凋亡。本研究发现，PEDF抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用具有剂量依赖性，这与娄志霞等［12］对人肺腺癌A549细胞、刘正兵等［13］对肺大细胞癌NCI-H460细胞的研究结果一致。因此，PEDF有望成为治疗肺癌的辅助用药。

参考文献:

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［12］娄志霞，束军，金程，等.PEDF对人肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响［J］.安徽医科大学学报，2014，49( 10) : 1361-1364.

［13］刘正兵，束军.色素上皮衍生因子对非小细胞肺癌NCI-H460细胞增殖和凋亡的影响［J］.安徽医科大学学报，2013，48( 6) : 604-606.

·临床研究·

收稿日期:( 2015-04-02)

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0034-03

文献标志码:A

中图分类号:R734.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.013