LBH589对肾癌细胞株OS-RC-2增殖的影响及机制探讨

马俊健，陈婷，刘彬，徐米清( 广州医科大学附属第二医院，广州5400;2广州市番禺区妇幼保健院; 广州心血管疾病研究所)

LBH589对肾癌细胞株OS-RC-2增殖的影响及机制探讨

马俊健1，2，陈婷1，刘彬3，徐米清1
( 1广州医科大学附属第二医院，广州511400;2广州市番禺区妇幼保健院; 3广州心血管疾病研究所)

摘要:目的观察LBH589对肾癌细胞株OS-RC-2细胞增殖的影响，并探讨其机制。方法将人肾癌细胞株OS-RC-2细胞分为DMSO组、N-乙酰半胱氨酸( NAC)组、LBH589组和NAC + LBH589组，NAC组加入5 mmol/L NAC刺激2 h，LBH489组加入50 nmol/L LBH589刺激48 h，NAC + LBH589组先加入5 mmol/L NAC预处理2 h，洗脱后再以50 nmol/L LBH589刺激48 h。EdU法测算细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡、活性氧簇( ROS)，Western blotting法检测细胞p-STAT3、Cyclin D1蛋白。结果DMSO组、NAC组、LBH589组、NAC + LBH589组EdU染色阳性细胞比例分别为53%±4%、52%±5%、7%±3%、29%±6%，细胞凋亡率分别为0.25%±0.13%、0.18%±0.15%、11.35%±2.40%、1.92%±0.63%，ROS分别为0.60%±0.26%、0.33%±0.25%、12.2%± 2.65%、5.33%±1.05%，DMSO组、NAC + LBH589组与LBH589组比较，P均＜0.05。DMSO组、NAC组、LBH589组、NAC + LBH589组p-STAT3相对表达量分别为1.00±0.07、1.02±0.07、0.49±0.04、0.52±0.05，Cyclin D1相对表达量分别为1.00±0.08、1.03±0.08、0.45±0.04、0.49±0.03，DMSO组与LBH589组比较，P均＜0.05。结论LBH589对OS-RC-2肾癌细胞生长有抑制作用，其可能与诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、升高ROS水平有关。LBH589能抑制STAT3信号通路，进而使Cyclin D1表达下降，而LBH589诱导ROS升高不是通过抑制STAT3信号通路从而使肾癌细胞生长抑制。

关键词:肾肿瘤;肾癌;细胞增殖;细胞凋亡;组蛋白去乙酰化酶抑制剂

Effect of LBH589 on cell proliferation of renal carcinoma cell line OS-RC-2 and its mechanism

MA Jun-jian1，CHEN Ting，LIU Bin，LI Ai-qun，XU Mi-qing
( 1 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 511400，China)

Abstract:Objective To observe the influences of LBH589 on cell proliferation of renal cancer cell line OS-RC-2 and to explore its mechanism.Methods OS-RC-2 cells were divided into the DMSO group，N-acetyl cysteine ( NAC) group，LBH589 group and NAC +LBH589 group.NAC group was stimulated with 5 mmol/L of NAC for 2 h，LBH489 group was stimulated with 50 nmol/L of LBH589 for 48 h，and the NAC +LBH589 group was pre-treated with 5 mmol/L of NAC for 2 h and then after elution，the group was stimulated with 50 nmol/L of LBH589 for 48 h.EdU assay was used to measure cell proliferation，flow cytometry was used to detect the apoptosis and reactive oxygen species ( ROS)，while Western blotting was used to detect p-STAT3 and Cyclin D1 proteins.Results The proportions of positive Edu cells in the DMSO group，NAC group，LBH589 group and NAC +LBH589 group were respectively 53%±4%，52%±5%，7%±3% and 29%±6%.The apoptosis rates of the corresponding groups were 0.25%±0.13%，0.18%±0.15%，11.35%±2.40% and 1.92%± 0.63%.ROS of the corresponding groups were 0.60%±0.26%，0.33%±0.25%，12.2%±2.65% and 5.33%± 1.05%.Significant difference was found between the DMSO，NAC +LBH589 groups and the LBH589 group ( all P＜0.05).The relative expression of p-STAT3 was 1.00±0.07，1.02±0.07，0.49±0.04 and 0.52±0.05 in the DMSO group，NAC group，LBH589 group and NAC +LBH589 group.The relative expression of Cyclin D1 was 1.00±0.08，1.03±0.08，0.45 ±0.04 and 0.49±0.03 in the corresponding groups.Significant difference was found between the DMSO group and the LBH589 group ( all P＜0.05).Conclusions LBH589 inhibits the growth of renal cancer cell line OS-RC-2，which may be related to induction of apoptosis，inhibition of cell proliferation and the increased ROS level.LBH589 can inhibit STAT3 sig-

naling pathway，thus decrease the expression of Cyclin D1.However，LBH589-induced ROS increase is not achieved through the inhibition of STAT3 signaling pathway to inhibit the growth of renal cancer cells.

Key words:kidney neoplasms; renal cell carcinoma; cell proliferation; apoptosis; histone deacetylase inhibitor

肾细胞癌( RCC)的治疗以根治性手术为主，放疗及化疗效果不理想，手术后复发率大于20%［1］。因此，寻找和研发新的抗肾癌药物十分必要。组蛋白去乙酰化酶抑制剂( HDACIs)可通过细胞周期阻滞、诱导分化和凋亡等机制［2，3］对血液系统肿瘤和一些实体肿瘤有明显抑制作用［4，5］。但HDACIs对肾癌细胞抑制作用的研究尚未见报道。HDACIs能提高细胞内活性氧簇( ROS)水平，降低抗氧化系统作用，抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡。LBH589为一种新的HDACIs类药物。本研究观察了LBH589诱导的氧化应激对肾癌细胞株OS-RC-2增殖的影响，并探讨其可能的机制。

1　材料与方法

1.1细胞及试剂LBH589、N-乙酰半胱氨酸( NAC)购自Sigma公司;肾癌细胞株OS-RC-2(中国科学院细胞库) ;胎牛血清、RPMI1640完全培养基、胰蛋白酶购自Gibco公司; MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、EdU试剂盒购自广州锐博公司;总ROS检测试剂盒购自Enzo Life Sciences公司;兔抗人p-STAT3、Cyclin D1、GAPDH单抗，羊抗兔二抗购自美国Santa Cruzs公司。

1.2细胞培养将人肾癌细胞株OS-RC-2细胞培养于含100 mL/L血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI1640培养液中，待细胞贴壁生长达到80%以上时进行传代培养。细胞进行药物刺激时，各实验组培养基的DMSO终浓度为0.1%。

1.3 LBH589药物浓度筛选采用MTT法检测细胞生长情况。取对数生长期OS-RC-2细胞接种于96孔板，每孔0.2 mL。24 h后弃孔内液体，每孔分别加入100 μL浓度为0、10、50、100、500、1 000 nmol/L LBH589的培养基，药物处理24、48、72 h，每组5个复孔，每孔加50 μL 1×MTT，培养4 h，弃上清，每孔加150 μL DMSO，测D550值，实验重复5次，取平均值。MTT实验结果显示，LBH589呈时间和剂量依赖性抑制OS-RC-2细胞增殖，LBH589作用OS-RC-2细胞24、48、72 h，IC50分别为220、50、38 nmol/L，因此选择50 nmol/L LBH589处理OS-RC-2细胞。

1.4细胞分组及LBH589干预将生长状态良好的细胞接种于培养板，分为DMSO组、NAC组、LBH589组和NAC + LBH589组。各设3个复孔，NAC组加入5 mmol/L NAC刺激2 h，LBH489组加入50 nmol/L LBH589刺激48 h，NAC + LBH589组先加入5 mmol/L NAC预处理2 h，洗脱后再以50 nmol/L LBH589刺激48 h。

1.5细胞增殖检测采用EdU法。取各组细胞行EdU标记、细胞固化、EdU染色、Hoechst33342染色，激光共聚焦显微镜观察并计算每个视野中的EdU染色阳性细胞百分比，共计算10个视野。激光共聚焦显微镜图像分析显示新增殖细胞经EdU染色后表现为红色荧光，所有活细胞经Hoechst33342染色后表现为蓝色荧光，Overlay为红色荧光和蓝色荧光的重叠图片。

1.6细胞凋亡检测采用流式细胞术。取各组对数生长期OS-RC-2细胞接种于培养皿，药物刺激后PBS 洗2次，胰蛋白酶消化细胞，收集至相应的流式管内，行AnnexinV、PI染色，流式细胞仪检测，分析凋亡细胞百分率，实验重复5次，取平均值。

1.7细胞ROS检测采用流式细胞技术。取各组对数生长期OS-RC-2细胞接种于培养皿。药物刺激后PBS洗2次，胰蛋白酶消化细胞，收集至相应的流式管内，离心，PBS洗2次，每个流式管各加500 μL ROS Detection Solution，37℃避光30 min，流式仪检测分析细胞内ROS表达水平，实验重复5次，取平均值。

1.8细胞p-STAT3、Cyclin D1表达检测采用Western blotting法。取各组对数生长期细胞药物处理后弃培养液，PBS洗2次，加入细胞裂解液、蛋白酶抑制剂，收集裂解混合液，12 000 r/min离心15 min，BCA法测定浓度。取30 μg蛋白标本为上样量，经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜，最后加入GAPDH、p-STAT3、Cyclin D1一抗和二抗，之后曝光显影，重复5次，以Image J2x软件进行灰度分析，取平均值。

1.9统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用单因素方差分析。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组细胞增殖情况比较DMSO组、NAC组、LBH589组、NAC + LBH589组EdU染色阳性细胞比例分别为53%±4%、52%±5%、7%±3%、29%± 6%，DMSO组、NAC + LBH589组与LBH589组比较，P均＜0.05。

2.2各组细胞凋亡率比较DMSO组、NAC组、LBH589组、NAC + LBH589组细胞凋亡率分别为0.25%±0.13%、0.18%±0.15%、11.35%± 2.40%、1.92%±0.63%，DMSO组、NAC + LBH589组与LBH589组比较，P均＜0.05。

2.3各组细胞ROS比较DMSO组、NAC组、LBH589组、NAC + LBH589组细胞ROS分别为0.60%±0.26%、0.33%±0.25%、12.2%± 2.65%、5.33%±1.05%，DMSO组、NAC + LBH589组与LBH589组比较，P均＜0.05。

2.4各组细胞p-STAT3和Cyclin D1蛋白表达比较结果见表1。

表1　各组OS-RC-2细胞p-STAT3和Cyclin D1蛋白表达比较(±s)

表1　各组OS-RC-2细胞p-STAT3和Cyclin D1蛋白表达比较(±s)

注:与DMSO组比较，*P＜0.05。

组别p-STAT3　Cyclin D1 DMSO组1.00±0.07　1.00±0.08 NAC组　1.02±0.07　1.03±0.08 LBH589组　0.49±0.04*　0.45±0.04*NAC + LBH589组0.52±0.05　0.49±0.03

3　讨论

本实验结果表明，LBH589对OS-RC-2肾癌细胞增殖有明显的抑制作用，其抑制率具有浓度依赖性和时间依赖性。EdU增殖试验结果显示OS-RC-2细胞经50 nmol/L LBH589处理48 h后，细胞增殖数量明显减少。流式细胞术结果同样显示，50 nmol/L LBH589刺激OS-RC-2细胞48 h，其细胞凋亡比例比DMSO组明显增加。ROS的大量产生可能是细胞凋亡的关键事件之一［6，7］。LBH589能显著诱导OS-RC-2细胞ROS生成，NAC能减少LBH589作用细胞后ROS产生，从而减弱LBH589抑制细胞增殖及促细胞凋亡作用。这可能与LBH589处理细胞后细胞的氧化还原状态如ROS的堆积密切相关，而NAC作为一种强大的抗氧化剂及自由基清除剂能够保护肾癌细胞，对抗LBH589对OS-RC-2细胞的生长抑制作用。

STAT3持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化，目前已被公认为癌基因［8，9］。它能调控目标基因的表达，如通过上调Bcl-xL、McL-1、Cyclin D1和c-myc基因的作用参与肿瘤的形成［10，11］。Cyclin D1是参与细胞周期的重要调节因子，过度表达的Cyclin D1可以调节细胞周期前进，加快肿瘤细胞的增殖速度。LBH589作用OS-RC-2肾癌细胞后p-STAT3、Cyclin D1的表达明显下降，LBH589抑制p-STAT3及下游靶基因蛋白Cyclin D1的表达使细胞周期进程受阻从而使细胞增殖受到抑制。NAC预处理后再以LBH589刺激48 h，p-STAT3、Cyclin D1蛋白表达与LBH589组相比没有统计学差异。这可能因为LBH589诱导细胞产生的大量ROS并不是通过抑制STAT3信号通路使肾癌细胞生长抑制，而是通过其他的方式和途径引起细胞凋亡，这需要通过进一步的实验来证实。

可见，LBH589对OS-RC-2肾癌细胞生长有抑制作用，其抗肿瘤机制可能与诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、升高ROS水平有关。LBH589能抑制STAT3信号通路，进而使Cyclin D1表达下降，而LBH589诱导ROS升高不是通过抑制STAT3信号通路从而使肾癌细胞生长抑制。

参考文献:

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008［J］.CA Cancer J Clin，2008，58( 2) : 71-96.

［2］Ahmad M，Hamid A，Hussain A，et al.Understanding histone deacetylases in the cancer development and treatment: an epigenetic perspective ofcancer chemotherapy［J］.DNA Cell Biol，2012，31 ( Suppl 1) : 62-71.

［3］XU M，Hong M，Xie H.Histone deacetylase inhibitors induce human renal cell carcinoma apoptosis through p-JNK activation［J］.J South Med Univ，2013，33( 10) : 1409-1415.

［4］Dashwood RH，Myzak MC，Ho E.Dietary HDAC inhibitors: time to rethink weak ligands in cancer chemoprevention［J］.Carcinogenesis，2006，27( 2) : 344-349.

［5］Vanhaecke T，Papeleu P，Elaut G，et al.Trichostatin A-like hydroxamate histone deacetylase inhibitors as therapeutic agents: toxicological point of view［J］.Curr Med Chem，2004，11( 12) :1629-1643.

［6］Liu YB，Gao X，Deeb D，et al.Pristimerin Induces Apoptosis in Prostate Cancer Cells by Down-regulating Bcl-2 through ROS-dependentUbiquitin-proteasomal Degradation Pathway［J］.J Carcinog Mutagen，2013，Suppl 6: 005.

［7］Kim TH，Kim JS，Kim ZH，et al.Khz-cp ( crude polysaccharide extract obtained from the fusion of Ganoderma lucidum and Polyporus umbellatusmycelia) induces apoptosis by increasing intracellular calcium levels and activating P38 and NADPH oxidase-dependent generation of reactive oxygen species in SNU-1 cells［J］.BMC Complement Altern Med，2014，14: 236.

［8］Zhao J，Lin W，Cal Z，et al.Total alkaloids of Rubus aleaefolius Poir.inhibit the STAT3 signaling pathway leading to suppression of proliferation and cell cycle arrest in a mouse model of hepatocellular carcinoma［J］.Oncol Rep，2013，30( 3) : 1309-1314.

［9］Lu L，Li C，Li D，et al.Cryptotanshinone inhibits human glioma cell proliferation by suppressing STAT3 signaling［J］.Mol Cell Biochem，2013，381( 1-2) : 273-282.

［10］Grabenstatter HL，Del Angel YC，Carlsen J，et al.The effect of STAT3 inhibition on status epilepticus and subsequent spontaneous seizures in the pilocarpinemodel of acquired epilepsy［J］.Neurobiol Dis，2014，62: 73-85.

［11］Guo S，Zhi Y，Yang H，et al.Bcl-2 expression is associated with poor prognosis of solitary plasmacytoma of bone［J］.Ann Hematol，2014，93( 3) : 471-477.

收稿日期:( 2015-05-27)

通信作者简介:徐米清( 1964-)，男，主任医师，主要研究方向为肾脏疾病的诊断与治疗。E-mail: gyeyxu@163.com

作者简介:第一马俊健( 1988-)，男，硕士研究生，主要研究方向为肾脏疾病的诊断与治疗。E-mail: mjjtt121@163.com

基金项目:广东省高等学校优秀青年教师培养计划项目( Yq2013133)。

文章编号:1002-266X( 2015)31-0008-03

文献标志码:A

中图分类号:R737.11

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.003