磷酸化PKC-δ对地塞米松诱导大鼠成骨细胞凋亡的影响

付文举，张德志，王国喜，刘玉林( 泰州市第二人民医院，江苏泰州5500;辽宁医学院附属第一医院)

磷酸化PKC-δ对地塞米松诱导大鼠成骨细胞凋亡的影响

付文举1，张德志2，王国喜1，刘玉林1
( 1泰州市第二人民医院，江苏泰州225500;2辽宁医学院附属第一医院)

摘要:目的观察磷酸化PKC-δ对地塞米松( Dex)诱导的大鼠成骨细胞凋亡的影响。方法取新生SD大鼠颅骨第3代成骨细胞，分为对照组、Dex组( 1×10－7mol/L Dex)、PMA预处理组( 1×10－7mol/L Dex + 100 nmol/L PMA)、Rottlerin预处理组( 1×10－7mol/L Dex +2 μmol/L Rottlerin)，培养24 h后采用MTT法检测细胞增殖活性，采用Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术和吖啶橙/溴乙锭( AO/EB)荧光染色法检测细胞凋亡，采用Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及磷酸化PKC-δ。结果与对照组相比，Dex组细胞增殖活性低，细胞凋亡多，磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表达高，Bcl-2表达低( P均＜0.05)。与Dex组相比，PMA预处理组细胞增殖活性低，细胞凋亡多，磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表达高，Bcl-2表达低( P均＜0.05)。与Dex组相比，Rottlerin预处理组细胞增殖活性高，细胞凋亡少，磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表达低，Bcl-2表达高( P均＜0.05)。结论磷酸化PKC-δ可促进Dex诱导的大鼠成骨细胞凋亡。

关键词:蛋白激酶C-δ;半胱氨酸蛋白3; B细胞淋巴瘤相关蛋白x; B细胞淋巴瘤2;成骨细胞;细胞调亡

Effect of phosphorylated PKC-δ on Dexamethasone-induced osteoblast apoptosis of rats

FU Wen-jyu1，ZHANG De-zhi，WANG Guo-xi，LIU Yu-lin
( Second People＇s Hospital of Taizhou，Taizhou 225500，China)

Abstract:Objective To observe the effect of phosphorylated protein kinase C-δ( PKC-δ) on Dexamethasone ( Dex) -induced osteoblast apoptosis of rats.Methods The osteoblasts of the third generation from newly born SD rats' calvaria were divided into four groups: the control group，Dex group ( 1×10－7mol/L Dex)，PMA preconditioning group ( 1× 10－7mol/L Dex +100 nmol/L PMA) and Rottlerin preconditioning group ( 1×10－7mol/L Dex + 2 μmol/L Rottlerin).The cells of each group were incubated for 24 h.Then，the cell proliferation activity was measured by MTT assay，the apoptosis was detected by AnnexinⅤ-FITC/propidium iodide ( PI) -flow cytometry ( FCM) and acridine oringe/ethidium bromide ( AO/EB) staining，and the expression of the apoptosis-related proteins ( Bcl-2，Bax and Caspase-3) and phosphorylated PKC-δ was detected by Western blotting.Results Compared with the control group，the proliferation activity was reduced，the apoptosis was increased，the expression of phosphorylated PKC-δ，Caspase-3 and Bax was increased，while the Bcl-2 expression was decreased in the Dex group，and the difference was statistically significant ( all P＜0.05).Compared with the Dex group，the cell proliferation activity was reduced，the apoptosis was increased，the expression of phosphorylated PKC-δ，Caspase-3 and Bax was increased，while the Bcl-2 expression was decreased in the PMA preconditioning group，and the difference was statistically significant ( all P＜0.05).Compared with the Dex group，the cell proliferation activity was obviously higher，the apoptosis was decreased，the expression of phosphorylated PKC-δ，Caspase-3 and Bax was decreased，while the Bcl-2 expression was increased in the Rottlerin preconditioning group，and the difference was statistically significant ( all P＜0.05).Conclusion The phosphorylated PKC-δ can promote the Dex-induced osteoblast apoptosis of rats.

Key words:protein kinase C-δ; caspase-3; B-cell lymphoma related protein x; B-cell lymphoma 2; osteoblasts; apoptosis

糖皮质激素诱导的股骨头坏死是股骨头坏死的主要原因之一，其病理生理机制中涉及蛋白激酶C ( PKC)信号途径的激活［1］。PKC-δ是PKC家族的重要成员，可参与多种细胞凋亡因子刺激诱导的细胞凋亡［2～4］，但在成骨细胞凋亡方面的研究较少。在细胞凋亡的调控因素中，凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax一直备受关注。因此，本研究观察了磷酸化PKC-δ对Dex诱导的大鼠成骨细胞凋亡的影响，为明确Dex诱导成骨细胞凋亡的分子机制提供依据。

1　材料与方法

1.1实验动物与试剂出生24 h内SD大鼠10只，购自辽宁医学院动物培养中心。胎牛血清、DMEM/F12培养基、胰蛋白酶购自Heclone公司，吖啶橙、溴乙锭、Ⅰ型胶原酶、MTT购自Sigma公司，茜素红为国产，PKC-δ选择性抑制剂Rottlerin、PKC激活剂佛波酯( PMA)购自美国Calbiochem公司，抗磷酸化PKC-δ一抗购自北京博奥森试剂有限公司，Annexin V-FITC流式检测试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1成骨细胞的分离培养与鉴定取所有大鼠颅骨，采用酶消化法分离成骨细胞，按1×105/mL浓度接种于25 mL细胞培养瓶中，用含10% FBS的DMEM/F12培养，置于5%CO2、37℃培养箱中，24 h后首次换液，以后每2 d换液1次，待细胞融合至80%左右时，进行传代，取第3代成骨细胞用于实验。采用倒置相差显微镜观察细胞形态和茜素红染色钙结节的方法鉴定。24 h内细胞贴壁，形态上呈多形性，主要为长梭形，胞质有突起，向外伸展; 1周后，细胞呈“铺路石”样排列，多数呈鳞片状，体较大，多伪足，胞质丰富，胞核较大;继续培养，可见局部多层生长，并有黑色钙结节生成。

1.2.2成骨细胞凋亡模型建立取70%～80%融合的第3代成骨细胞，更换新鲜培养液，分为对照组(未做任何处理)、Dex组(调节培养液中Dex浓度为1×10－7mol/L)、PMA预处理组(调节培养液中Dex浓度为1×10－7mol/L、PMA浓度为100 nmol/L)、Rottlerin预处理组(调节培养液中Dex浓度为1× 10－7mol/L、Rottlerin浓度为2 μmol/L)，置于培养箱中继续培养24 h。

1.2.3成骨细胞增殖活性检测采用MTT法。取上述四组细胞，以1×105/mL接种于96孔板，每组8复孔，置于培养箱中继续培养24 h后吸弃上清，加入培养液稀释的MTT( 1 mg/mL)，每孔10 μL，置培养箱中4 h;弃上清，加入等体积二甲亚砜，振荡10 min，结晶溶解，呈紫色溶液; BIO-RAD680型酶标仪490 nm波长测吸光度值。实验重复3次，取平均值。

1.2.4成骨细胞凋亡检测采用Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术和吖啶橙/溴乙锭( AO/EB)荧光染色法检测。参照Annexin V-FITC流式检测试剂盒说明收集上述四组细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3次，取平均值。取上述四组细胞，PBS冲洗2次，0.1 g/L的AO/EB混合液染色，凋亡细胞核呈现黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒，正常细胞呈绿色荧光，在荧光显微镜下观察200倍视野下，随机计数100个细胞中的凋亡细胞所占的比例。细胞凋亡率( %) = (凋亡细胞/计数细胞总个数)× 100%。

1.2.5各组成骨细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、磷酸化PKC-δ检测采用Western blotting法。取上述四组细胞，以添加磷酸酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞，获取胞质蛋白。等量蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，然后转至硝酸纤维素膜。以5%脱脂奶粉室温封闭2 h，与抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体、抗Caspase-3抗体及抗磷酸化PKC抗体( 1∶400稀释) 4℃孵育过夜，与HRP标记羊抗兔IgG室温孵育1 h，用ECL显影在柯达胶片上。同一膜用洗脱液洗脱，检测β-actin表达( Abcam一抗1∶3 000稀释)作为内对照。实验重复3次，取平均值。

1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组细胞增殖活性比较对照组、Dex组、PMA预处理组、Rottlerin预处理组细胞吸光度值分别为0.437±0.013、0.379±0.012、0.369±0.013、0.410± 0.010，Dex组与其他三组比较，P均＜0.05。

2.2各组细胞凋亡率比较流式细胞仪检测结果显示，对照组、Dex组、PMA预处理组、Rottlerin预处理组细胞凋亡率分别为3.5%±0.46%，19.0%± 0.54%、26.7%±0.69%、10.5%±0.35%，Dex组与其他三组比较，P均＜0.05。

AO/EB双荧光检测结果显示，对照组、Dex组、PMA预处理组、Rottlerin预处理组细胞凋亡率分别为2.9%±0.45%、20.6%±0.50%、33.4%± 0.55%、14.0%±0.30%，Dex组与其他三组比较，P均＜0.05。

2.3各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、磷酸化PKC-δ表达比较结果见表1。

表1　各组成骨细胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2、磷酸化PKC-δ表达比较(±s)

表1　各组成骨细胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2、磷酸化PKC-δ表达比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与Dex组比较，△P＜0.05。

组别　Caspase-3( 17 kDa)　 Caspase-3( 28 kDa)　Bax　Bcl-2　　磷酸化PKC-δ对照组　0.349 75±0.015 01　 0.323 91±0.013 72　 0.246 63±0.015 35　 0.653 42±0.022 06　 0.223 65±0.015 24 Dex组　0.610 23±0.038 94*　0.52 340±0.035 79*　0.374 51±0.035 03*　0.402 65±0.032 01*　0.613 25±0.038 47*PMA预处理组　0.704 21±0.043 25＊△0.715 39±0.038 97＊△0.539 78±0.040 87＊△0.294 62±0.030 79＊△0.734 25±0.041 98＊△Rottlerin预处理组　0.501 34±0.031 52＊△0.453 61±0.030 87＊△0.301 75±0.031 64＊△0.453 42±0.029 01＊△0.429 87±0.030 27＊△

3　讨论

Weinstein等［5］最早提出糖皮质激素能够诱导成骨细胞和骨细胞凋亡，进而导致骨细胞数量减少。随后的临床研究及动物实验研究［6，7］发现，激素性骨坏死所致股骨头中可见大量凋亡的骨细胞。本实验中我们用Dex成功诱导建立成骨细胞凋亡模型。另外，我们的前期实验研究［1］证明糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡与PKC通路相关。

PKC是一类富含丝/苏氨基酸的激酶，在机体组织细胞内广泛存在，目前已发现12种亚型，作为细胞信号的重要成分对机体多种细胞的增殖、分化及凋亡等方面起重要作用。在不同细胞中PKC各亚型作用各异，且受刺激因子不同和条件的影响［8，9］。PKC-δ可通过多种信号通路及相关蛋白诱导细胞凋亡［10，11］。Rottlerin为PKC-δ的特异性抑制剂，PMA为PKC激活剂。本实验中MTT法检测结果显示，Dex组细胞增殖活性低于对照组，Rottlerin预处理组细胞增殖活性高于Dex组，PMA预处理组细胞增殖活性低于Dex组。流式细胞仪检测及AO/EB双荧光染色结果均表明，与对照组比较，Dex组细胞凋亡明显增加，且PMA预处理组较Dex组细胞凋亡增加，Rottlerin预处理组较Dex组细胞凋亡减少。可见，Dex诱导的成骨细胞凋亡与PKC-δ的磷酸化有关。Bcl-2的同系物Mcl-1与PKC-δ参与的HaCaT细胞凋亡相关［12］。本实验检测结果显示磷酸化PKC-δ表达的变化与促凋亡蛋白Caspase-3 和Bax一致，与凋亡保护性蛋白Bcl-2相反。由此，进一步确认PKC-δ的高表达与细胞的凋亡相关，推测PKC-δ可能是通过促使Caspase-3、Bax的活化及抑制Bcl-2的表达水平，从而影响Dex诱导的成骨细胞细胞凋亡。但其具体的作用途径尚待进一步研究。

PKC-δ作用底物种类众多，该信号传导通路复杂，目前仍不断有新的PKC-δ作用途径提出，其最终的作用机制以及调解因子目前仍然没有得到确定。本实验在离体细胞水平上证实了PKC-δ是Dex诱导的成骨细胞凋亡中PKC途径的重要一环，Rottlerin可通过抑制PKC-δ的表达减少细胞的凋亡，但PKC-δ究竟是通过介导何种信号通路来参与Dex诱导的成骨细胞凋亡还有待进一步研究。

参考文献:

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·基础研究·

收稿日期:( 2015-05-02)

作者简介:第一付文举( 1986-)，男，住院医师，主要研究方向为骨坏死的病因与机制。E-mail: fuwenju2011@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 81041063)。

文章编号:1002-266X( 2015) 31-0020-03

文献标志码:A

中图分类号:R681

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.007