花色素对白血病细胞株K562细胞增殖的影响

谭利利，徐俊英，龚　珂，苏　圣，张玉敏，朱文慧，侯毅鞠

(吉林医药学院，吉林 吉林　132013)

·论著·

花色素对白血病细胞株K562细胞增殖的影响

谭利利，徐俊英，龚珂，苏圣，张玉敏，朱文慧，侯毅鞠*

(吉林医药学院，吉林 吉林132013)

摘要：目的研究花色素对人红白血病细胞株(K562细胞)增殖的影响,探讨花色素抗肿瘤作用。方法取对数生长期的K562细胞，分为阴性对照组、不同浓度K562组及阳性对照组进行体外培养，通过镜下观察花色素对K562细胞生长状态的影响；通过绘制K562细胞生长曲线、噻唑蓝(MTT)比色法、瑞氏染色观察花色素对K562细胞增殖的影响。结果细胞加药处理后，镜下观察加药组细胞分散，胞体减小，死亡细胞明显增多；瑞氏染色,光学显微镜观察加药组细胞形态明显改变，胞体大小不一，胞质浓染，核浆比例减小，趋于分化成熟，可见中晚幼细胞；MTT结果证实，随着花色素浓度从25 μg/mL增加到200μg/mL，细胞生长抑制率逐渐增加，并呈浓度和时间依赖性。结论花色素能够抑制 K562 细胞增殖。

关键词：花色素；K562细胞；细胞增殖

文章编号：1673-2995(2015)02-0095-03

中图分类号：R285

文献标识码：识码： A

Abstract:ObjectiveTo study the antitumor effect of anthocyanin on human leukemia cell (K562). MethodsK562 cells in logarithmic growth phase were divided into different groups and the cells growth pattern in different groups were observed through microscope.The cell growth curve of K562 were measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay and the changes of cell morphology in different groups were observed by Wright’s staining.The above methods were used to estimated the effects of anthocyanin on proliferation of K562 cells. ResultsCells were observed under the microscope after dosing.With dispersion,the cell body decreased,dead cells increased significantly.Wright's staining showed that the dosing group cells morphology changed obviously,the cell body vary in size,cytoplasmic dense staining,nucleocytoplasmic ratio decreasing and tending to the differentiation and maturation,and the middle and late immature cells were visible.The MTT results confirmed that with the anthocyanin concentration increased from 25 μg/mL to 200 μg/mL,the cell growth inhibition rate increased in dose and time dependent manner. Conclusion Anthocyanidin can inhibit the proliferation of K562 cells.

基金项目：吉林省大学生创新创业训练计划项目.

作者简介：谭利利(1990-)，女(瑶族)，本科在读.

通讯作者：侯毅鞠(1974-)，女(汉族)，副教授,硕士.

收稿日期：( 2014-08-17)

Proliferation inhibition of anthocyanin on leukemia cell K562

TAN Lili,XU Junying,GONG Ke,SU Sheng,ZHANG Yumin,ZHU Wenhui,HOU Yiju*(Jilin Medical College,Jilin City,Jilin Province,132013,China)

Key words: flower pigment,K562 cell,cell proliferation

K562细胞是一种分化极差、恶性程度较高的人红白血病细胞株。研究证明，其在体外可被多种诱导剂诱导，可分别向红系、粒系、单核巨嗜细胞系及巨核细胞系分化[1-3]。花色素是一类分布十分广泛的植物色素，具有类黄酮的典型结构[4]。有研究表明，花色素对人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等肿瘤细胞具有生长抑制作用。其作用机制与抗氧化作用、抑制肿瘤细胞增殖、诱导癌细胞凋亡和分化等有关,且对机体无明显不良反应[5]。本研究通过体外培养K562细胞，观察花色素对K562细胞的形态变化，探讨花色素对K562细胞关于增殖方面的作用，为临床上白血病的治疗提供新思路。

1材料与方法

1.1　材　料

花色素(购自上海惠诚责任有限公司)；RPMI-1640培养基(美国GIBCO公司)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT试剂盒(武汉博士生物工程有限公司)；CO2细胞培养恒温箱购于美国Forma Scientific公司;倒置相差显微镜(Olympus公司);96孔培养板(美国Falcon公司);流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司);自动酶标仪(BIORAD公司550型)。

K562细胞为吉林医药学院检验学院细胞室冻存细胞,接种K562细胞于含10%新生牛血清的 RPMI-1640完全培养基，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于试验。

1.2　细胞培养

常规传代培养K562细胞至对数生长期，将对数生长期细胞分成5组，以每孔1×105接种于96孔板中，24 h后分别加入花色素，使终浓度分别为25、50、100、200 mg/L，并设置对照组，培养24 h后于倒置显微镜下观察细胞状态并拍照。

1.3　瑞氏染色观察

常规传代培养K562细胞至对数生长期，将对数生长期细胞分成5组，24 h后分别加入花色素使终度分别为25、50、100、200 mg/L，并设置对照组，培养24 h后收集各组细胞，离心800 r/min，5 min，弃上清，将细胞沉淀涂布于载玻片上，甲醇固定10 min后取出，PBS冲洗，自然晾干，滴加瑞氏染液1 min后再加入等量的PBS，混匀，静置5 min后，细流水洗，吸干，镜检观察并拍照。

1.4　MTT法检测

取对数生长期K562细胞制成细胞悬液，浓度为1×105/mL，接种于96孔板内，每孔100 μL，加入不同浓度的花色素使终浓度分别为25、50、100、200 mg/L，每一浓度均设4个复孔，并设对照及凋零孔，分别在加药24、48、72 h后加入MTT溶液10 μL，37 ℃继续培养4 h，终止培养，离心1 000 r/min，5 min，弃去孔内培养液，每孔加入100 μL Formazan溶解液，振荡10 min，用酶联免疫检测仪在570 nm波长下测各孔吸光度，按下列公式计算抑制率。

1.5　统计学处理

2结果

2.1　花色素对K562生长的影响

细胞加药处理后，镜下观察发现花色素对K562细胞的生长有抑制作用，与对照组相比，加药组细胞分散，体积缩小，胞体减小，死亡细胞增多且明显(见图1)。经数据分析发现，不同浓度的花色素对K562细胞的生长均有抑制作用,呈浓度和时间依赖性(见图2)。

对照组　　　　　　　花色素组

图 2　K562细胞生长曲线

2.2　瑞氏染色

收集各组细胞涂片，瑞氏染色光学显微镜观察细胞形态，对照组细胞形态明显改变，胞体大小不一，不规则，胞质浓染，核浆比例减小，趋于分化成熟，可见中晚幼细胞(见图3)。

对照组　　　　　　　花色素组

2.3　花色素对K562细胞的生长抑制率作用

MTT结果证实，花色素能够明显抑制K562细胞生长，且有浓度依赖关系。随着浓度从25 μg/mL增加到200 μg/mL，对细胞生长抑制率也逐渐增加(见图4)。

图 4　不同浓度的花色素对K562细胞的抑制作用

3结论

人红白血病K562细胞是一株恶性程度较高的人红白血病体外细胞系，但在体外可被多种诱导剂诱导发生凋亡、分化和增殖抑制。因此K562细胞是临床和基础领域中筛选新的抗肿瘤药物和研究调控胚胎型和胎儿型珠蛋白基因表达的分子机制的常用模型[6]。有研究表明K562细胞能向红系发展而且K562细胞的血红蛋白合成是和其细胞不同程度的增殖诱导相联系的，而这种增殖诱导则取决于诱导剂的性质。

用25~200 μg/mL的花色素处理人红白血病K562细胞后，通过镜下观察发现，细胞形态发生明显变化。绘制的生长曲线也显示随着加入物浓度及时间的增长，细胞数逐渐减少。应用MTT比色法等检测发现花色素在体外可抑制K562细胞生长，并呈时间-剂量依赖性。

据国外统计，白血病约占肿瘤总发病率的3%左右，是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤。白血病的发病率在世界各国中，欧洲和北美发病率最高死亡率为3.2~7.4/10万人口。亚洲和南美洲发病率较低，死亡率为2.8~4.5/10万人口。因此，开发研究出一种天然高效的抗肿瘤药物是极具意义的。花色素具有一定的增殖抑制效应，同时本研究也表明其对K562细胞可能具有较强的抑制作用，提示该药具备较好的应用前景。

参考文献：

[1]Al-Nedawi K,Meehan B,Micallef J,et al.Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvⅢ by microvesicles derived from tumour cells[J].Nat Cell Biol,2008,10(5):619-624.

[2]Ribatti D,Vacca A,Dammacco F.The role of the vascular phase in solid tumor growth:a historical review[J].Neoplasia,1999,1(4):293-302.

[3]李静,沈宜,汤为学,等.小鼠肝癌细胞H22源exosomes的制备及其免疫相关蛋白的初步研究[J].中华肝脏病杂志,2007,15(6):437-440.

[4]李韬，张宏宇，吕玉璋.花色苷类色素的研究进展[J].农业科技与装备,2010(5):23-26.

[5]王修杰,袁淑兰,魏于全.原花色素的防癌抗癌作用[J].中草药,2004,25(7):830-833.

[6]危敏,马文丽,郑文岭.人红白血病K562细胞的红系终末分化研究[J].国外医学:输血及血液学分册,2005,25(3):210-212.