色季拉山8个杜鹃花野生种亲缘关系的ISSR分析

徐静静，张良英，赵 冰，郑茜子， 申惠翡， 袁柳祥

（1．西北农林科技大学风景园林艺术学院， 陕西 杨凌712100；2．西藏大学农牧学院， 西藏 林芝860000）

杜鹃花（Rhododendron）作为“十大名花”之一，分布广泛且栽培历史悠久。世界约有960种杜鹃花，我国约有550种［1］，杜鹃花与报春（Primula）和龙胆（Oentiana）被称为世界三大高山野生花卉［2］，在我国西藏有广泛的分布，《西藏植物志》中详细记载了170多种杜鹃花［3］。目前对西藏杜鹃花的研究主要集中于其群落分布以及从形态学角度分析种质资源问题［4－5］。

西藏色季拉山属湿润山地暖温带、半湿润山地温带气候，含有约25种杜鹃花种与变种［5］，资源丰富，对杜鹃花种质资源的研究有着重要的意义。利用ISSR分子标记对杜鹃花的研究已经有许多［6］，东北地区、云南以及陕西秦岭一带的杜鹃花资源都曾有学者研究［7－8］，但西藏杜鹃花资源的分子标记却未见报道。本研究利用ISSR分子标记技术对色季拉山8个杜鹃花野生种的亲缘关系进行研究，以期为色季拉山野生杜鹃花资源的开发利用和育种工作提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 采 样

本实验所用材料采集于色季拉山（表1），按种群采样法采集样本，每种采集20个样本，放入硅胶干燥带回，－70℃保存备用。

表1 8种杜鹃花的名称和采集地分布

图1 8个杜鹃花野生种间花部形态差异

1．2 总DNA的提取

采用CTAB法对硅胶干燥的叶片提取总基因组DNA，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计（Bio－RAD SmartpecMT 3000）检测DNA浓度。最后用双蒸水将DNA稀释到50ng／μL，－20℃保存备用。

1．3 引物筛选与PCR扩增

本实验所用引物参照加拿大哥伦比亚大学UBC公司公布的ISSR引物序列，由沃尔森生物工程技术服务有限公司合成。用每个种的DNA样本在25μL反应体系中对所选的49条引物进行筛选，最后选出8条扩增条带清晰、重复性好的引物，使用者对8条引物（UBC 811、UBC 819、UBC 826、UBC 834、UBC 835、UBC 841、UBC 842、UBC 856）所有样本进行 PCR扩增，得到扩增产物。

PCR扩增反应在北京君意公司生产的PCR仪上进行，反应体系采用25μL的Mix反应体系：1μL引物、1μL 模 板 DNA、12．5μL Taq mix、10．5μL ddH2O。扩增反应程序为94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸90s，45个循环；72℃延伸8min，4℃保存。

对扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳，使用Gene Genius公司的Bio Imaging System凝胶成像系统拍照，并记录数据。

1．4 数据处理

根据相同分子量DNA片段电泳迁移相同统计电泳结果，使用“0，1”数据记录，有DNA扩增条带记为1，无条带记为0，形成0／1矩阵。利用POPGENE软件进行相似性系数的分析，多态位点百分率（PPL）、有效等位基因（Ne）、Nei’s基因多样性指数（h）、Shannon信息指数（Ⅰ）。然后利用 NTSYSpc 2．1软件使用非加权算数平均法（UPGMA）对种群进行聚类分析，获得种群间亲缘关系树状图。

2 结果与分析

2．1 引物筛选与ISSR扩增片段

本实验的ISSR标记技术使用的是通用型引物，不同的引物对不同的物种扩增条带差异明显，若想获得条带多态性和稳定性都比较好的引物，则需要对不同的引物进行筛选。实验所提供的材料均为野生种，因此在引物筛选时需要使用这8个野生种的样本DNA对所选引物进行筛选，以获得能同时扩增该8个种且所得条带清晰明亮、多态性高、稳定性强的引物。本实验选取了UBC的49条引物，使用这49条引物对8个野生种的DNA进行扩增，分析得出，8个引物（表2）可对8个野生种扩增出条带清晰明亮、多态性高且稳定性强的条带。

利用这8个引物分别对8个种的样本DNA进行扩增，共获得343条带，其中多态性条带335条；每个引物可扩增出14～16位点，总共获得124个位点，其多态性位点123个，多态位点百分率为99．19%；扩增片段为250～2 000bp，得出了带型丰富的电泳图谱（图2）。

表2 对8个野生种样本进行扩增的ISSR引物

图2 引物UBC 856对8种杜鹃花种质资源的ISSR扩增电泳图

2．2 聚类分析

利用POPGENE 32对数据进行分析和计算，计算了有效等位基因数、多态位点百分率、Nei’s遗传距离、Shannon信息指数，据此分析了8个种间的亲缘关系。数据表明，8个种间的遗传距离为0．377 6～0．709 4，遗传相似性系数为0．491 9～0．685 5，雪层杜鹃与鳞腺杜鹃间的遗传距离最大，黄毛海绵杜鹃与硬毛杜鹃间的遗传距离最小。

利用NTSYSpc 2．1软件根据8个种之间的遗传相似性系数对这8个种进行UPGMA聚类分析，构建聚类树形图（图3）。可看出，在相似性系数约0．55处，8种杜鹃花被明显地聚成两类。第一类群中包含雪层杜鹃和柳条杜鹃；第二类群包含其余6种杜鹃花（硬毛杜鹃、黄毛海绵杜鹃、光蕊杜鹃、黄杯杜鹃、鳞腺杜鹃、白背紫斑杜鹃）被聚到了一个类群，其中硬毛杜鹃和黄毛海绵杜鹃的遗传相似性系数最大，约为0．69。

3 结论与讨论

ISSR分子标记技术具有操作简单、成本低、重复性高的优点，近年来被广泛用于品种鉴定分类［9］、品种起源［10］、亲缘关系的研究［11］和对濒危物种的遗传多样性分析［12］。本实验中使用筛选所得的8个引物对8个杜鹃花野生种进行扩增，共得到343条清晰条带，其中多态性条带335条，多态性条带比率为97．67%。图谱数据经分析所得的遗传距离为0．377 6～0．709 4，有效等位基因百分率为99．19%。所得数据表明，实验所用的8个野生资源可以利用ISSR标记技术对其亲缘关系进行分析。

表3 8种杜鹃花的遗传距离（对角线下）和遗传相似性系数（对角线上）

图3 8个杜鹃花野生种的遗传相似性系数聚类分析图

使用POPGENE软件分析数据所得的8个种的遗传距离为0．377 6～0．709 4；平均 Nei’s基因多样性指数为0．376 8，平均Shannon信息指数为0．557 6，这些数据表明，在这8个种群间有着明显的遗传差异。8个种间遗传相似性系数为0．491 9～0．685 5，在聚类分析中可以被聚到一起，且有明显分组。聚类分析结果表明，在这8个野生种间存在着遗传差异，并且有相同的遗传背景。

利用 NYSYSpc 2．1根据 Nei’s遗传相似性系数对8个杜鹃花野生种进行聚类分析，结果表明，在遗传相似性系数约为0．55处，8个野生种明显地被分为了两类。《中国植物志》、《西藏植物志》中将该8种杜鹃分为三大类，杜鹃亚属（雪层杜鹃、鳞腺杜鹃）、常绿杜鹃亚属（黄杯杜鹃、硬毛杜鹃、光蕊杜鹃、黄毛海绵杜鹃、白背紫斑杜鹃）、糙叶杜鹃亚属（柳条杜鹃）［13－15］，由聚类结果（图3）可看出，8种杜鹃花野生种的遗传相似性聚类与其形态分类不相符。雪层杜鹃和柳条杜鹃聚为一类，表明它们有相同的遗传背景，然而遗传相似性较低，在形态学分类上差异较大。白背紫斑杜鹃形态上被分为常绿杜鹃亚属，且属于常绿杜鹃组下的大理杜鹃亚组，与黄毛海绵杜鹃同处于同一亚组，在遗传相似性系数聚类分析中与黄毛海绵有着相同的遗传背景。由此可见，形态学分析可作为亲缘关系研究的辅助手段。

本研究利用ISSR标记技术初步分析了西藏色季拉山8种杜鹃花资源的亲缘关系，聚类分析结果未能和形态学分类相一致，这为进一步研究西藏杜鹃属植物分类提供分子水平的理论依据，为育种以及杂交组合提供理论依据，同时也为其种质资源保护利用提供理论基础。

［1］司国臣，张延龙，梁振旭，等．秦岭汉中地区野生杜鹃花种质资源调查研究［J］．浙江农林大学学报，2013（3）：350－353．

［2］赵冰，张果，司国臣，顾欣，等．秦岭野生杜鹃花属植物种质资源调查研究［J］．西北林学院学报，2013（1）：104－109．

［3］阂天檬，方瑞征，黄素华．西藏植物志［M］．北京：科学出版社，1986（3）：553－677．

［4］郑维列，潘刚，徐阿生，等．西藏色季拉山杜鹃花种质资源的初步研究［J］．园艺学报，1995（2）：166－170．

［5］唐晓琴．西藏色季拉山高寒杜鹃群落物种多样性特征［J］．四川林业科技，2011（4）：5－11．

［6］刘旭颖，沈向群，张艳红．9种耐寒杜鹃花亲缘关系ISSR分析［J］．西北农业学报，2010（7）：89－92．

［7］金则新，李钧敏，顾奇萍．云锦杜鹃自然居群遗传多样性的ISSR分析［J］．园艺学报，2006（6）：1 263－1 267．

［8］Liu YF，Xing M，Zhao W，et al．Genetic diversity analysis of Rhododendron aureum Georgi （Ericaceae）located on Changbai Mountain using ISSR and RAPD markers［J］．Plant Systematics and Evolution，2012，298（5）：921－930．

［9］邱英雄，胡绍庆，陈跃磊，等．ISSR－PCR技术在桂花品种分类研究中的应用［J］．园艺学报，2004（4）：529－532．

［10］李宗艳，秦艳玲，蒙进芳，等．西南牡丹品种起源的ISSR研究［J］．中国农业科学，2015（5）：931－940．

［11］董海燕，季孔庶，侯伯鑫，等．基于ISSR标记的红花檵木品种亲缘关系分析［J］．园艺学报，2014（2）：365－374．

［12］李雪萍，郭松，熊俊飞，等．广西野生濒危植物掌叶木遗传多样性的ISSR与SRAP分析［J］．园艺学报，2015（2）：386－394．

［13］阂天檬，方瑞征，黄素华．西藏植物志［M］．北京：科学出版社，1986（3）：553－677．

［14］方瑞征．中国植物志57（1）［M］．北京：科学出版社，1999：1－438．

［15］胡琳贞，方明渊．中国植物志57（2）［M］．北京：科学出版社，1994：19－213．