姜黄素对大脑中动脉缺血模型大鼠的神经保护作用及机制研究

李姝雅，王伊龙，王春雪，刘改芬，王拥军

脑缺血后局部炎性因子的表达显著增加，且急性炎性因子的升高程度与临床预后紧密相关[1]。Notch信号通路调控神经干细胞的浸润分化和血管新生[2-4]，并参与炎症反应过程[5]。研究发现，Notch 1可与经典炎性因子NF-κB共活化参与炎症反应的调控。姜黄素（curcumin），黄色粉末，为姜黄根茎的生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗血管粥样硬化及保护肝肾等多种生物学作用[6-7]。本研究拟通过公认的线栓法建立稳定的大鼠大脑中动脉梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，通过观察姜黄素对Notch 1和NF-κB的作用，进一步探讨其神经保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂

成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠93只，体重250～280 g，清洁级，由河北医科大学基础医学院动物实验中心提供。姜黄素（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）：用含0.5 mol/L NaOH的0.01 PBS配制，浓度12.5 mg/ml。

1.2 试验动物分组与给药

1.2.1 姜黄素对Notch 1和NF-κB表达的影响 试验动物分为三组（63只）：①姜黄素组（CUR）：参照Longa线栓法制作大鼠右侧MCAO模型。在MCAO模型基础上按80 mg/kg剂量腹腔注射配制好的姜黄素溶液。②溶剂对照组（vehicle-control）：在MCAO模型基础上按80 mg/kg剂量腹腔注射含0.5 mol/L NaOH的0.01 PBS。③假手术组（sham）：除不在颈内动脉插入线栓外，其余步骤同Longa线栓法操作，模型制作完成后按80 mg/kg剂量腹腔注射含0.5 mol/L NaOH的0.01 PBS。每组均按时间点分为对照、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h共7个亚组，每个亚组3只大鼠。用免疫组化和Western blot的方法测定Notch 1和NF-κB的动态表达。

1.2.2 姜黄素急性脑缺血的神经保护作用 30只大鼠随机分配至CUR组、vehicle-control组、sham组，建模48 h评价神经功能学评分，5只用于脑含水量测定，5只用于梗死体积测定。

1.3 试验方法

1.3.1 神经功能学评分 Longa改良评分法：0分：没有神经功能缺损；1分：左侧（瘫痪侧）前爪不能完全伸展；2分：左侧（瘫痪侧）前肢不能伸展；3分：行走时，大鼠向左侧（瘫痪侧）转大圈；4分：行走时，大鼠向左侧（瘫痪侧）转小圈；5分：行走时，大鼠身体向左侧（瘫痪侧）倾倒[8]。

1.3.2 脑含水量的测定 将成功入组的大鼠在相应时间点麻醉后断头处死，取出完整脑组织，前去额极，后去部分枕叶，留取脑组织中间部分厚约4 mm。将脑组织放入事先称重的锡箔纸中包好称重，减去锡箔纸重量即得湿重。将包有锡箔纸的脑组织放入95℃烤箱内烘干24 h，取出待测脑组织恢复到室温，反复称量至恒重，减去锡箔纸重量即得干重。脑组织含水量：（湿重-干重）/湿重×100%。

1.3.3 脑梗死体积百分比测定 大鼠麻醉断头处死后，取出完整新鲜脑组织，连续切成2 mm厚的冠状组织切片，置于新鲜配制的2%的2，3，5-三苯基四唑氮红（triphenyltetrazolium chloride，TTC）中，37℃孵育30 min。用Olympus SP560数码相机采取图像，Image Pro-Plus 5.1分析系统对图片进行分析。总梗死体积=总梗死面积×脑片的厚度。水肿修正后梗死体积=对侧半球体积-（损伤侧半球体积-损伤侧半球梗死体积）。梗死体积百分比（%）=修正后梗死体积/对侧半球体积。

1.3.4 免疫组织化学法检测Notch 1和NF-κB阳性细胞 按照SP试剂盒说明书（北京中杉生物工程有限公司）进行免疫组织化学染色。所用Notch 1兔抗大鼠多克隆抗体（1∶400，Abcam Biotechnology），NF-κB P65兔抗大鼠多克隆抗体（1∶150，Santa Cruz Biotechnology）。光镜下胞质中棕黄色颗粒为阳性产物。

1.3.5 Western blot法检测Notch 1和NF-κB蛋白按照总蛋白提取试剂盒说明书（北京普利莱公司）提取蛋白，BCA蛋白检测试剂盒（美国Novagen）测定蛋白浓度。取等质量的样本蛋白（30 μg），进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（初始电压80 V 1 h，后100 V 1 h）；将标本蛋白转移至PDVF膜上；TBST洗涤3次，每次5 min；加入TBST稀释的一抗（兔抗大鼠Notch 1抗体，1∶300，Abcam Biotechnology，兔抗大鼠NF-κB P65抗体，1∶100，Santa Cruz Biotechnology），4℃摇床过夜。TBST洗涤3次，每次10 min；封闭2 h后加入荧光标记的二抗工作液（1∶6000，Rockland），室温下避光振荡1 h。TBST洗涤3次，每次10 min；图像扫描分析。

1.4 统计分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素下调了Notch 1和NF-κB在MCAO中的表达

与vehicle-control组相比，CUR组中Notch 1和NF-κB表达下调，比较差异有显著性（P＜0.05）。见表1、图1和图2。

2.2 姜黄素降低神经功能评分

与vehicle-control组相比，CUR组降低MCAO后48 h时神经功能评分，比较差异有显著性（P＜0.05）。见图3。

2.3 姜黄素减轻脑水肿

用干湿重法测得的脑组织含水量结果显示：sham组为（78.16±8.00）%，vehicle-control组为（83.71±7.00）%，CUR组的脑组织含水量较vehicle-control组有所下降，为（80.42±9.00）%，比较差异有显著性（P＜0.05）。见图4A。

2.4 姜黄素减少梗死体积

脑梗死体积测定结果显示，CUR组为（28.94±6.20）%，低于vehiclecontrol组的（40.08±3.66）%，比较差异有显著性（P＜0.05）。见图4B。

3 讨论

表1 免疫组织化学阳性细胞数的动态表达

图1 免疫组织化学阳性细胞数的动态表达

姜黄素是从姜科姜黄属植物的根茎中提取的一种植物多酚，是姜黄发挥药理作用最重要的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护肝肾功能等多种生物学功能。在宫颈癌的研究中发现，姜黄素可通过降低Notch和NF-κB的表达起到抗癌作用，说明姜黄素与Notch通路间存在联系[9-10]。姜黄素用于治疗缺血性脑血管病，可减少脑水肿和梗死面积，改善神经功能学评分，其作用机制尚未明确。研究证实，姜黄素能升高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，降低脑缺血病灶周围的氧化应激反应，挽救缺血半暗带的神经元，减轻缺血后脑损伤。炎症反应在缺血后脑损伤机制中的作用已得到共识，NF-κB作为炎症反应的核心因子，在缺血性脑损伤中起到重要作用。姜黄素通过抑制NF-κB的表达，干扰下游基因的转录发挥抗炎作用。对于姜黄素的抗炎作用是否可作为其脑保护作用机制之一，本实验结果提示，姜黄素可同步降低缺血后脑组织中NF-κB和Notch 1的表达，推测Notch信号通路可能通过调节NF-κB的表达参与姜黄素的脑保护作用。

图2 不同时间点测定Western blot蛋白表达水平

图3 不同组别神经功能学评分

图4 姜黄素对脑含水量及梗死体积的影响

1 Lopes LR，Zekavati A，Syrris P，et al. Genetic complexity in hypertrophic cardiomyopathy revealed by high-throughput sequencing[J]. J Med Genet，2013，50：228-239.

2 Oya S，Yoshikawa G，Takai K，et al. Attenuation of Notch signaling promotes the differentiation of neural progenitors into neurons in the hippocampal CA1 region after ischimic injury[J]. Neuroscience，2009，158：683-692.

3 Chen J，Zacharek A，Li A，et al. Atorvastatin promotes presenilin-1 expression and Notch 1 activity and increases neural progenitor cell proliferation after stroke[J]. Stroke，2008，39：220-226.

4 Hellström M，Phng LK，Hofmann JJ，et al. Dll4 signalling through Notch 1 regulates formation of tip cells during angiogenesis[J]. Nature，2007，455：776-780.

5 Arumugam TV，Chan SL，Jo DG，et al. Gamma secretase-mediated Notch signaling worsens brain damage and functional outcome in ischemic stroke[J].Nat Med，2006，12：621-623.

6 Chan WH，Wu HJ. Protective effects of curcumin on methylglyoxal-induced oxidative DNA damage and cell injury in human mononuclear cells[J]. Acta Pharmacol Sin，2006，27：1192-1198.

7 Tong QS，Zheng LD，Lu P，et al. Apoptosis-inducing effects of curcumin derivatives in human baldder cancer cells[J]. Anticancer Drugs，2006，17：279-287.

8 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J]. Stroke，1989，20：84-91.

9 Hackler L Jr，Ózsvári B，Gyuris M，et al. The curcumin analog C-150，influencing NF-κB，UPR and Akt/Notch pathways has potent anticancer activity in vitro and in vivo[J]. PLoS One，2016，11：e0149832.

10 Liu S，Cao Y，Qu M，et al. Curcumin protects against stroke and increases levels of Notch intracellular domain[J]. Neurol Res，2016，38:553-559.