狗蚁草不同萃取部分含药血清对HSC-T6细胞增殖的影响

通信作者：郑作文，教授，主要从事中药药理研究。E-mail:zzw_nn@163.com

狗蚁草不同萃取部分含药血清对HSC-T6细胞增殖的影响

吴霜曹思思郑作文*

广西中医药大学药理教研室，广西南宁530001

【摘要】目的：探究狗蚁草不同萃取物对肝星状细胞(HSC-T6)增殖的影响。方法：制备狗蚁草不同溶剂萃取物的含药血清，通过MTT法检测含药血清对肝纤维化体外模型HSC-T6增殖的影响。结果：狗蚁草乙酸乙酯萃取物10%、5%、2.5%含药血清、95%乙醇提取物10%含药血清对HSC-T6细胞增殖有抑制作用。结论：狗蚁草乙酸乙酯萃取物和95%乙醇提取物能够抑制HSC-T6细胞的增殖，其中狗蚁草乙酸乙酯萃取物活性优于95%乙醇提取物。

【关键词】狗蚁草；肝纤维化；肝星状细胞

基金项目：广西自然科学基金(NO:2013GXNSFAA019112)。

作者简介：吴霜，硕士研究生在读，主要从事中药药理研究。E-mail:512086863@qq.com

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2015)22-0023-02

Abstract:Objective To investigate the activity of different extracts of Alysicarpus Vaginalis (L.) DC in anti-hepatic fibrosis .Methods Prepareing medicated serum of different extracts of Alysicarpus Vaginalis(L.)DC. To study the influence of medicated serum on the growth of HSC-T6 cell that is a vitro model of hepatic fibrosis by the MTT method. Results Compared with blank control group, the 10%, 5%, 2.5% of medicated serum of ethyl acetate extract and the 10% of medicated serum of 95% alcohol extract of Alysicarpus Vaginalis(L.)DC significantly inhibite the growth of HSC-T6 cell. Conclusion The ethyl acetate extract and the 95% alcohol extract of Alysicarpus Vaginalis(L.)DC are active in anti-hepatic fibrosis, the effect of the ethyl acetate extract is better than the 95% alcohol extract.

Keywords:Alysicarpus Vaginalis(L.)DC; hepatic fibrosis; HSC-T6

收稿日期：(2015.08.07)

The Influnence of Medicated Serum of Different Extracts ofAlysicarpusVaginalis(L.) DC on the Growth of HSC-T6 Cell

WU ShuangCAO SisiZHENG Zuowen*

Department of Pharmacology of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001,China

狗蚁草为豆科链荚豆属植物狗蚁草Alysicarpusvagnalis(Linn.) DC.的全草，又名练荚豆、假花生、山土豆、大叶青等，主要分布于广西、广东、海南、云南等地[1]。狗蚁草性凉，味甘、苦，具有去腐生肌、活血通络、清热化湿的功效，临床用于治疗筋骨酸痛、慢性肝炎、跌打损伤等[2]。狗蚁草为广西的道地药材，民间用其来治疗慢性肝炎，但迄今为止，狗蚁草抗肝纤维化作用的研究在国内外未见有报道。实验通过肝纤维化体外HSC-T6细胞模型来研究狗蚁草不同溶剂萃取物的抗肝纤维化活性。

1仪器与材料

1.1药材狗蚁草由广西中医药大学药用植物教研室韦松基教授鉴定为豆科植物链荚豆Alysicarpusvagnalis(Linn.) DC.的全草。

1.2实验动物昆明种小鼠(清洁级)48只，雌雄各半，体重(20±2)g，由广西中医药大学实验动物中心提供，合格证号：桂医动字第11004号。

1.3细胞株HSC-T6细胞购买于上海博蕴有限公司。

1.4材料石油醚(分析纯，批号：20130820，成都市科龙化工试剂厂)；氯仿(分析纯，批号：20130518，成都市科龙化工试剂厂)；正丁醇(分析纯，批号：20130409，成都市科龙化工试剂厂)；乙酸乙酯(分析纯，批号：201305040，成都市科龙化工试剂厂)；DMSO(批号：020120709370，Amresco)；青链霉素混合液(批号：1491907，Gibco)；胎牛血清(批号：121005，浙江天杭生物科技有限公司)；MTT(批号：410c051，Solarbio)；秋水仙碱(批号：C8190，北京索莱宝科技有限公司)。

1.5仪器Epoch酶标仪(美国BIO-TEK公司)；311型CO2培养箱(美国ThermoForma公司)；TB-215型丹佛精密天平(德国赛多利斯公司)；HVE-50型自动高压灭菌器(日本HIRAYAMA公司)；DLE560型超净工作台(荷兰Clean Air公司)；明澈-D 24 UV超纯水仪(法国默克密理博公司)；G3型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)。

2实验方法

2.1含药血清的制备取狗蚁草干燥药材，剪碎，称重，置于开口反应器中加适量95%乙醇浸泡过夜，次日加入药材12倍量的95%乙醇，回流提取3次。依次保持微沸状态2、1.5、1h，过滤，合并3次滤液，减压浓缩，干燥，得95%乙醇部位提取物。将95%乙醇提取后的药材晒干，加入12倍量纯水，按上述95%乙醇的提取步骤进行提取，得到水提物。取适量95%乙醇提取物，加水溶解，依次用用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩提取液，干燥，得狗蚁草石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。取昆明种小鼠48只，雌雄各半，随机分为空白对照组、秋水仙碱组、95%乙醇提取物组、石油醚萃取物组、氯仿萃取物组、乙酸乙酯萃取物组、正丁醇萃取物组、水提取物组，每组雌雄各3只。阳性对照组给秋水仙碱0.8mg/kg，空白对照组给纯水，其余各组给予相应药物，灌胃给药，给药剂量均相当于生药量112 g/kg，灌胃容积均为20ml/kg，连续5d，每天2次。最后一次给药(灌胃前禁食不禁水12h)1h后，摘眼球取血，3000rpm离心10min，取上清，于56℃下温育30 min灭活，过滤除菌。每组药物含药血清设10%、5%、2.5%三个浓度，5%和2.5%含药血清组再分别加入5%和7.5%空白对照小鼠血清，使各组培养液总血清含量均为10%[3]。

2.2对HSC-T6细胞增殖的影响取处于对数生长期的HSC-T6细胞，消化制成单细胞混悬液，取适量混悬液，用0.4%Trypan Blue染色，在显微镜下计数，活细胞百分数应大于90%。调整细胞浓度至5×103个/ml，取细胞悬液接种于96孔板中，100μl/孔，37℃、5% CO2的培养箱中培养，24h后吸出96孔板中的原培养液，加入相应含药血清培养液200μl，每组药物的含药血清分别设4个复孔，37℃、5% CO2的培养箱中培养，24h后每孔加入MTT溶液(5mg/ml)15μl，37℃培养4h，吸去上清液，每孔加DMSO 150μl，室温下用微量振荡器震荡10min，酶标仪双波长法测吸光度A570/630(检测波长570nm，参照波长630nm)，根据抑制率=(对照组A570/630 - 给药组孔A570/630)/对照组A570×100%计算抑制率。

3结果

由表1可知，狗蚁草不同萃取物含药血清作用于HSC-T6细胞24h后，其乙酸乙酯萃取物含药血清在10%、5%、2.5%三个浓度下，HSC-T6细胞增殖明显低于空白对照组(P<0.05)；狗蚁草95%乙醇提取物含药血清在10%浓度下，HSC-T6细胞增殖明显低于空白对照组(P<0.05)；HSC-T6细胞在狗蚁草石油醚、氯仿、正丁醇、水提取物含药血清培养液中的增殖与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1　狗蚁草不同提取物含药血清对HSC-T6细胞增殖的影响 ± s， n=4)

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

4讨论

肝纤维化是指由各种致病因素引起的肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀，是细胞外基质的合成持续大于细胞外基质降解的结果，是各种慢性肝脏疾病发展的必经阶段[4]。肝纤维化的发生涉及肝星状细胞(HSC-T6)、肝细胞、Kupffer细胞、窦内皮细胞等多种细胞以及多种细胞因子和酶，其中肝星状细胞的激活是肝纤维化的关键环节[5]。当肝脏细胞受到损伤时，机体就会分泌血小板源性生长因子、转化生长因子β、肝细胞生长因子等激活静息状态的肝星状细胞，激活的肝星状细胞大量增殖，并转化为肌成纤维细胞合成大量的细胞外基质[6]，导致细胞外基质合成增加降解减少。鉴于肝星状细胞在肝纤维化发展中的重要作用，研究以肝星状细胞为靶细胞，建立肝纤维化体外模型用于抗肝纤维化药物的筛选有重要意义[7]。中药化学成分复杂，如果直接加入到细胞培养体系中，化学成分的理化性质可能干扰实验结果导致假阳性的产生。另外，中药的化学成分未必是发挥疗效的成分，有些药物需经过机体代谢后才产生具有疗效的物质。所以直接将中药或成分复杂的提取物加入到培养体系中研究其药效是不大合适的，而含药血清药理学方法是将药物作用于动物后，取动物血清作为药物加入到培养体系中，可以很好避免上述弊端[8-9]。MTT法可以检测细胞活力和数目，灵敏度高，重复性好，简单易操作，快速、经济而且无放射污染，广泛用于细胞增殖实验[10]。故实验采用MTT法检测狗蚁草不同溶剂萃取物的含药血清对HSC-T6细胞增殖的作用，结果显示，狗蚁草乙酸乙酯提取物10%、5%、2.5%含药血清、95%乙醇提取物10%含药血清对HSC-T6的增殖有抑制作用，表明狗蚁草乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物可能具有抗肝纤维化活性，且狗蚁草乙酸乙酯提取物抗肝纤维化活性可能优于95%乙醇提取物。

参考文献

[1] 李兰兴，彭家崇，异叶链荚豆引种观察及利用研究[J].中国草原与牧草，1985，2(1)：40-42.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草[M ].上海：上海科学技术出版社，1999：326.

[3] 王勤，王巍，龙颖，等.罗汉果甜苷对肝星状细胞 HSC-T6增殖及肝纤维化相关基因的影响[J].中草药，2013，44(3)：331.

[4] 张斌.肝纤维化的发病机理研究进展[J].现代诊断与治疗，2004，15(6)：354.

[5] 叶国荣.肝星状细胞在肝纤维化中的作用[J].现代消化及介入诊疗，2007，12(10)：90.

[6] 张哲，郭津生.肝星状细胞的起源与功能[J].中华临床医师杂志，2010，4(4)：459-462.

[7] 刘哗，齐荔红，王硕丰，等.肝星状细胞HSC-T6体外肝纤维化模型的建立[J].药学实践杂志，2005，23(6)：339-342.

[8] 崔晓兰，贺玉琢，高英杰，等.中药药理研究的新思路-中药学清药理学[J].中国中医药科技，1997，4(4)：239.

[9] 田代真一.血清药理学和血清药化学[J].现代东洋医学，1992，13 (1)：113-117.

[10] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival[J].Immuno Methods, 1983,65(1)：55-63.